植物組織培養(yǎng)六-展示頁
2025-01-22 05:05本頁面
【正文】 的細胞懸浮液放入放入15ml刻度離心管中于 2023g離心 5min。細胞生長的測定對于任何一個建立的細胞懸浮系都應該進行動態(tài)的測定，以掌握其生長的基本規(guī)律，為繼代培養(yǎng)或其他研究提供依據(jù)。繼代前 ，培養(yǎng)容器靜置短時間，大細胞團沉降，再吸上層懸浮液。D、如果使處在 靜止期的細胞懸浮液保持時間太長 ，則會引起細胞的大量死亡和解體 。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時間組織或細胞的培養(yǎng)基。 討論 : A、滯后期的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉入細胞數(shù)量的多少。檢查時將懸浮細胞取一滴放在載玻片上，滴一滴 %酚藏紅花，蓋上蓋玻片，染成紅色的是死細胞，無色的是活細胞。具體操作： 取 ，加入FDA溶液，使最后濃度達到 %，混勻，室溫下作用 5min，熒光顯微鏡觀察。 最低有效密度由于培養(yǎng)材料、原種培養(yǎng)條件，原種保存時間長短、培養(yǎng)基的成分不同而有差異，一般為 104~105細胞 /ml（ 2）細胞記數(shù)要保證細胞培養(yǎng)的最低有效密度，在細胞游離后要對分離的單細胞進行記數(shù)，可用血球記數(shù)板。為了提高細胞的分散度，對于生長素和細胞分裂素的比例需要進行一些調節(jié)。 細胞可以不斷增殖，形成高密度 的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。wheelcultureforsuspensionsfor2. 細胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture) 一、細胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義 懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。 繼代多次，以獲得均勻一致疏松的愈傷組織。1 酶 解法Takebe等（ 1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠 酶過濾 、離心由培養(yǎng)組織分離單細胞 莖段步驟搖 床用于振 蕩繼 代 懸 浮(3)（ Suspension culture)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物15ml medium/1g120rpm culture Transfer1 time/3d 3 weeks100130目網 過濾Centrifuge(離心） isolation注意 ： 選擇適宜的外植體 ：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。4. 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與次生產物生產 n 167。2. 懸浮培養(yǎng) n 167。n 167。 第七章 細胞培養(yǎng) 植物細胞培養(yǎng)（ plant cell culture）是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖的技術根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模 :小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；根據(jù)培養(yǎng)方式 :懸浮培養(yǎng)、單細胞培養(yǎng)等；根據(jù)要求產物 :用于誘變的細胞培養(yǎng)和生產次生產物的細胞培養(yǎng)。 1. 單細胞分離 n 167。3. 單細胞培養(yǎng)技術 n 167。1. 單細胞分離由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織中分離單細胞由完整的植物器官分離單細胞葉片是分離單細胞的最好材料機械法酶解法撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞1 機械法第一種方法：用刀片刮葉片第二種方法：葉片研碎、離心研碎成粉加研磨介質過濾、離心只有薄壁組織排列松散，細胞間接觸點很少時用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。 選擇適宜的培養(yǎng)基 ：較高濃度激素濃度，特別是生長素，必要的附加物質，例如水解酪蛋白、 Pro、 Gln。 167。Bioreactorcontinuous cellShakersuspensionCultureCell suspensionPlants Artificial seedsSecondary productsIsolation protoplasts Mutation select細胞懸浮培養(yǎng)的應用 三 .細胞懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)基 對于用愈傷組織制備的懸浮細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基以原愈傷組織繼代時的培養(yǎng)基除去瓊脂為好。 培養(yǎng)細胞的起始密度及細胞記數(shù)（ 1）最低有效密度的概念 在懸浮細胞培養(yǎng)中，使懸浮培養(yǎng)細胞能夠增殖的最少接種量稱為最低有效密度或者臨界的起始密度。（ 3）活細胞測定除測定細胞密度外，尚需要測定活細胞率以作為測定起始密度的參考活細胞率（ %） =（ 5個視野中的活細胞數(shù)/5個視野中的細胞總數(shù)） 100% 活細胞測定的方法；A、醋酸酯熒光素（ FDA）染色法 FDA本身無熒光，無極性，可自由通過原生質體膜進入細胞內部，進入后由于 受到活細胞內脂酶分解 ， 而產生有熒光的極性物質熒光素，不能自由出入原生質體膜 ，在熒光顯微鏡下觀察到的熒光是有活力的，反之無活力。B、酚藏紅花染色法 先配制 %酚藏紅花溶液，溶劑為培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)細胞數(shù)目的增殖變化細胞生長各個時期的特點：滯后期 （延遲期） :細胞很少分裂，其長短與接種量 大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關對數(shù)生長期 :細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變直線生長期 :細胞生長和發(fā)育最明顯的時期緩慢期 :生長逐漸緩慢 ,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝 物質增多，氧氣減少靜止期 :生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。B、加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。C、 縮短兩次繼代時間間隔 ，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持對數(shù)生長期。操作注意事項：對懸浮培養(yǎng)細胞繼代時，進液口的孔徑要小，只能通過單細胞或小細胞團（ 2 4細胞），使用吸管或注射器。依此，多次，可建立良好的細胞懸浮培養(yǎng)物。A、細胞記數(shù)注意：由于懸浮培養(yǎng)的細胞并不會呈游離單細胞，因此 通過培養(yǎng)瓶中直接取樣很難進行可靠的細胞記數(shù)。以每毫升培養(yǎng)液中細胞體積的毫升數(shù)來表示。干重一般是將離心收集的細胞轉移到預先稱重的濾紙片上，然后在 60℃ 烘 12h，在干燥器中冷卻后稱
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