【正文】 激素選擇3～5個(gè)水平，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。2．滲透調(diào)節(jié)劑：常選用一些代謝微弱的糖來充當(dāng)，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，這些糖基本上不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，而只存留在培養(yǎng)基中，起到調(diào)節(jié)滲透的作用。1．活性炭：能從培養(yǎng)基中吸附許多有機(jī)物和無機(jī)物分子，可清除培養(yǎng)中植物組織在代謝過程中產(chǎn)生的、對(duì)培養(yǎng)物有不良或毒副作用的物質(zhì)，也可以調(diào)節(jié)激素的供應(yīng)。它是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，但并不是培養(yǎng)基中的必需成分，只是作為一種凝固劑使培養(yǎng)基變成固體或半固體狀態(tài)。 （五）、瓊脂或其他支持物 除液體懸浮培養(yǎng)外，所有的培養(yǎng)物都應(yīng)生長(zhǎng)在固體或半固體的培養(yǎng)基上,以防止培養(yǎng)物沉人液體培養(yǎng)基，因缺氧而死亡。3．赤霉素 ：主要是GA3。 常用的天然CTK主要有：玉米素,玉米素核苷，二氫玉米素 。但2，4D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動(dòng)根和芽分化的培養(yǎng)基中。常用的生長(zhǎng)素有：NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)，2，4，5一T(2，4，5一三氯苯氧乙酸)。 （四）、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 在植物組織培養(yǎng)中使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等。 幾乎所有的培養(yǎng)物在蔗糖作為碳源時(shí)生長(zhǎng)都比較好，只有少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更合適。另外，在某些植物或某些組織的培養(yǎng)中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。 （二）、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分 維生素: 除維生素B維生素B煙酸之外，在部分培養(yǎng)基中還添加維生素C(抗壞血酸)、維生素H(生物素)等。 主要包括鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、氯(C1)、硼(B)和鉬(Mo)等。缺硫時(shí)培養(yǎng)的植物組織會(huì)明顯的退綠；缺磷或鉀時(shí)細(xì)胞會(huì)過度生長(zhǎng)，愈傷組織表現(xiàn)出極其蓬松狀態(tài)。鎂：常以MgS04 鈣：常以CaCl2H2O、KH2P04或(NH4)H2P04的形式提供。缺氮時(shí)愈傷組織會(huì)出現(xiàn)花色素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能形成導(dǎo)管。一、培養(yǎng)基的成分（一）、無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分(包括大量元素，微量元素和鐵鹽)大量元素：／L的元素。例如，White培養(yǎng)基是Uspenski和Uspenskaia(1925)的藻類培養(yǎng)基演化的結(jié)果，被廣泛用于根的培養(yǎng)；Gautheret培養(yǎng)基是建立在Knop營(yíng)養(yǎng)液(1865)基礎(chǔ)上的。檢測(cè)與觀察記錄室最好單獨(dú)設(shè)立一個(gè)房里面擺放實(shí)體解剖鏡、普通光學(xué)顯微鏡、顯微照相和記錄設(shè)備 。培養(yǎng)室內(nèi)的地面、墻壁、培養(yǎng)架及所有器物的表面都應(yīng)經(jīng)常清洗、擦拭以防過多灰塵和微生物滋生。培養(yǎng)室內(nèi)所有光照和黑暗應(yīng)由定時(shí)器自動(dòng)控制。3)℃，相對(duì)濕度應(yīng)在50％～60%。 五、培養(yǎng)室 培養(yǎng)室最重要的是要恒溫、恒濕，無塵且空氣流通。房間內(nèi)最好裝有紫外燈或經(jīng)常噴灑殺菌劑，以抑制過多微生物生長(zhǎng)。 四、接 種 室 接種室是對(duì)培養(yǎng)的植物材料進(jìn)行無菌操作的地方，應(yīng)有超凈工作臺(tái)、放置培養(yǎng)容器的架子等。 三、滅 菌 室 滅菌室面積可小一些，其內(nèi)除放滅菌鍋外，最好還有臨時(shí)存放培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿的架子，也應(yīng)有自來水裝置。 宜于零上低溫存放的化學(xué)藥品: 有機(jī)物、激素應(yīng)當(dāng)在一20℃下保存的藥品： 液體抗生素等。室內(nèi)還應(yīng)放一臺(tái)大容量的冰箱，用來分門別類地保存激素、抗生素和各種需低溫保存的物品。第四章 植物組織培養(yǎng)所需的基本設(shè)備與條件一個(gè)理想的植物組織培養(yǎng)室應(yīng)包括：化學(xué)藥品室；培養(yǎng)基配制室；滅菌室；接種室；培養(yǎng)室；培養(yǎng)物的檢測(cè)和觀察記錄室。 再分化——由無分化的愈傷組織細(xì)胞再轉(zhuǎn)變成為具有一定結(jié)構(gòu)，執(zhí)行一定生理功能的細(xì)胞團(tuán)和組織，構(gòu)成一個(gè)完整的植物體或植物器官的過程。 二、細(xì)胞分化、脫分化與再分化 細(xì)胞分化——分生性細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生永久性(不可逆轉(zhuǎn)性)適度變化的過程。從理論上講，只要是一個(gè)活的細(xì)胞，都有再生出一個(gè)完整植株的潛力，但實(shí)際情況并非如此簡(jiǎn)單。由于這一方法有巨大的實(shí)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起“蘭花工業(yè)” 。 1967年，Bourgin和Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。1972年，Carlson等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種。原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破： 1960年Cocking等用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。19581959年，Reinert和Steward分別報(bào)道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細(xì)胞胚。1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂素比率的函數(shù)。Muir等還用機(jī)械方法由細(xì)胞懸浮液和容易散碎的愈傷組織中分離得到單細(xì)胞，把它們置于一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂。 19531954年，Muir進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷不但可以促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，而且還能解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)芽形成的抑制作用，誘導(dǎo)芽的形成，從而確定了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。Gautheret(1934)在山毛柳等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，雖然在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織可以不斷增殖幾個(gè)月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，形成層組織的生長(zhǎng)才能顯著增加。他后來(1937)用3種B族維生素（吡哆醇、硫胺素和煙酸），取代酵母浸出液獲得成功。1934年，White成功離體培養(yǎng)了番茄的根尖。 1904年Hannig在無機(jī)鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長(zhǎng)到成熟。試管花第二章 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史一、 探索階段(20世紀(jì)初至20世紀(jì)30年代中) 20世紀(jì)初，德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可不斷分割，直至分到單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)，并設(shè)想離體細(xì)胞具有再生完整植株的潛力。 用人工種皮包被體細(xì)胞胚制造人工種子，為稀有和珍貴物種的繁殖提供了一種高效的手段。（3）通過細(xì)胞培養(yǎng)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行突變體選擇，可在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而提高選擇效率，節(jié)省時(shí)間和土地面積。組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫可經(jīng)濟(jì)有效地保存植物種質(zhì)資源 組織培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)不可或缺的組成部分；作物育種（1）單倍體育種：采用花藥培養(yǎng)可縮短雜合體純化所需的時(shí)間，節(jié)省土地，假定兩個(gè)雜交親本在n個(gè)獨(dú)立遺傳的位點(diǎn)上彼此不同，通過花藥培養(yǎng)，在理論上只要有2n個(gè)F1代花粉植株，就有可能得到一個(gè)所需要的基因組合，而傳統(tǒng)育種方法，則至少要有4n個(gè)F1植株才能得到一個(gè)所需要的基因組合。如用培養(yǎng)的人參懸浮細(xì)胞來生產(chǎn)人參皂苷。第一章 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)可應(yīng)用于以下幾個(gè)方面 ：1．挽救瀕于滅絕的植物；2．快速繁殖稀有植物或有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物；生產(chǎn)脫毒苗；利用組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應(yīng)器；多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量不足，甚至瀕于滅絕。利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)的方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生產(chǎn)；可不再依附于自然環(huán)境，不僅可以解決現(xiàn)有困難，而且可以通過篩選高產(chǎn)有效成分的細(xì)胞系，來提高其藥用價(jià)值。利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織作為生物反應(yīng)器，也可生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等。（2）在遠(yuǎn)緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，通過幼齡合子胚培養(yǎng)可以克服受精后障礙，通過體細(xì)胞融合還有可能制造出細(xì)胞質(zhì)雜種。 （4）體細(xì)胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個(gè)變異來源。用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、基因工程、植物發(fā)育等的基礎(chǔ)研究。Haberlandt首次進(jìn)行了離體細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，在1902年發(fā)表的“植物離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)”報(bào)告中，提出了胚囊液在組織培養(yǎng)中的作用和看護(hù)培養(yǎng)法等科學(xué)的預(yù)見。Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交形成的不能成活的胚剖出，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交中利用的可能性；1922年，美國(guó)的Robbins和德國(guó)的Kotte分別報(bào)道培養(yǎng)離體根尖獲得某些成功。 二、 奠基階段(20世紀(jì)30年代中至50年代末) White（1934年）在番茄根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基包含無機(jī)鹽、酵母浸出液和蔗糖。認(rèn)識(shí)了B族維生素對(duì)植物生長(zhǎng)的重要意義。1939年Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。因此，Gautheret、White和Nobecourt一起被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人。 1952年，Morel和Martin首次證實(shí)，通過莖尖離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無病毒植株。把萬壽菊和煙草的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，放在搖床上振蕩，形成了由單細(xì)胞和細(xì)胞聚集體組成的細(xì)胞懸浮液。 1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分離出一種首次為人所知的細(xì)胞分裂素，并把它定名為激動(dòng)素(kinetin)。1958年，Steward等以胡蘿卜為材料，首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Haberlandt關(guān)于細(xì)胞全能性的設(shè)想，成為了植物組織培養(yǎng)研究歷史中的一個(gè)里程碑。 三、迅速發(fā)展階段(20世紀(jì)60年代至現(xiàn)在) 基礎(chǔ)研究： 1965年，Vasil和Hildebrandt用一種化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，由分隔培養(yǎng)的煙草單細(xì)胞獲得了完整的再生植株，進(jìn)一步證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性 。1971年，Takebe等首次獲得了煙草原生質(zhì)體再生植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)取得顯著成績(jī)： 1964年，Guha和Maheshwari報(bào)道，在毛曼陀羅中通過離體花藥培養(yǎng)由小孢子直接發(fā)育成胚。 微繁技術(shù)得到廣泛應(yīng)用 1960年，Morel建立了一個(gè)離體無性繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。第三章 植物組織培養(yǎng)有關(guān)的基本概念一、植物細(xì)胞全能性(totipotency) 細(xì)胞全能性:指一個(gè)活的植物細(xì)胞，只要有完整的膜系統(tǒng)和細(xì)胞核，它就會(huì)有一整套發(fā)育成一個(gè)完整植株的遺傳基礎(chǔ)，在一個(gè)適當(dāng)?shù)臈l件下可以通過分裂、分化再生成一個(gè)完整植株。就目前所知，細(xì)胞的再生潛力與其分化程度呈負(fù)相關(guān)，就是說細(xì)胞分化程度越高其再生能力越低，所以應(yīng)盡量選取幼嫩的植物組織作為培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)材料。脫分化——由失去分裂能力的細(xì)胞回復(fù)到分生性狀態(tài)并進(jìn)行分裂，形成無分化的細(xì)胞團(tuán)（即愈傷組織）的過程。 三、器官發(fā)生 器官發(fā)生——由愈傷組織的部分細(xì)胞先分化產(chǎn)生芽(或根)，再在另一種培養(yǎng)基上產(chǎn)生根(或芽)，形成一個(gè)完整植株。 一、化學(xué)藥品室 應(yīng)配置幾個(gè)藥品櫥、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、萬分之一和百分之一的電子天平。組織培養(yǎng)所需主要藥品的存放要求如下： 可室溫存放的藥品：無機(jī)物、蔗糖、 鹽酸、氫氧化鈉，95％酒精，瓊脂。 二、培養(yǎng)基配制室 需要大于40m2的一個(gè)房間或更大些，為了方便起見可將房間分為兩個(gè)區(qū):一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥區(qū)：二是培養(yǎng)基配制區(qū)：應(yīng)有大型實(shí)驗(yàn)臺(tái)若干個(gè)，還應(yīng)配備常溫冰箱一臺(tái)，電爐(1000W，2000W)，微波爐，放置移液管、微量移液器的架子，酸度計(jì)等。滅菌室可根據(jù)滅菌鍋的多少，工作量大小來確定面積，要求房間能有較好的通風(fēng)散熱條件，且要配備專門的電源線路，因?yàn)殡姛釡缇伒暮碾娏亢艽蟆Ｕ麄€(gè)房間最好設(shè)有緩沖間和雙層門窗，以防灰塵和微生物。工作人員在進(jìn)入接種室之前在緩沖間內(nèi)更換衣服、鞋帽、穿好工作服，戴上口罩、防塵帽，換上拖鞋才能進(jìn)入接種區(qū)，進(jìn)入接種區(qū)之后隨手把活動(dòng)門關(guān)上。溫度應(yīng)維持在(25177。培養(yǎng)室內(nèi)有規(guī)律地安放培養(yǎng)架或搖床。整個(gè)培養(yǎng)室內(nèi)還應(yīng)裝有一個(gè)或多個(gè)紫外燈，以便能定時(shí)對(duì)整個(gè)房間進(jìn)行殺菌處理，特別是在夏天潮濕、霉雨季節(jié)，最好每天在晚上用紫外燈殺菌30 min以上。 六、培養(yǎng)物的檢測(cè)與觀察記錄室 對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行及時(shí)的檢測(cè)和觀察記錄是研究植物組織培養(yǎng)的重成部分之一，如不及時(shí)觀察記錄或?qū)ε囵B(yǎng)物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理變化以及培養(yǎng)基變化等進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)，就不可能獲得準(zhǔn)確有效一手資料，也就不能及時(shí)地發(fā)現(xiàn)和找出問題，提出解決問題的方法和改進(jìn)培養(yǎng)的方案。第五章 植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)基配制目前所使用的培養(yǎng)基有10余種之多，大部分都是在前人研究的基礎(chǔ)上經(jīng)過分析綜合和改進(jìn)而成的。以后的培養(yǎng)基大部分是在White和Gautheret培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。氮：常以硝態(tài)氮(N03)或氨態(tài)氮(NH4)，或兩者相互配合的形式存在。 磷：常以NaH2P04鉀：常以KCl、KN03或KH2P04形式。2H2O、Ca(N03)2。7H2O的形式，既提供了鎂也提供了硫。 2．微量元素：／L的元素。 鐵作為一種微量元素，對(duì)植物也是必需的，但由于Fe的特殊性質(zhì)，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時(shí)常常把Fe鹽單獨(dú)配制，且常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合劑乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)先分別配成溶液，再相互混合使形成螯合鐵，以防止沉淀和幫助被植物吸收。甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(環(huán)己六醇):肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式參與由Ca介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 （三）、碳水化合物用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或葡萄糖，用量通常為2％～4%，高者可達(dá)5％，亦可用市售的白糖所代替。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇和乳糖作為碳源的。1．生長(zhǎng)素：主要被用于誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。對(duì)愈傷組織增殖最有效的是2，4一D，特別是對(duì)單子葉植物。 2．細(xì)胞分裂素 使用細(xì)胞分裂素的主要目的是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長(zhǎng)高，抑制根的生長(zhǎng)。常用的人工合成CTK主要有: 激動(dòng)素(KT)、6芐基腺嘌呤(6BA)、2ip(異戊烯氨基嘌呤)、和TDZ(thidiazuron，噻二唑苯基脲)等 。用時(shí)需過濾滅菌；促進(jìn)試管苗伸長(zhǎng)。瓊脂是一種極為理想的支持物。（六）