【正文】 類物質(zhì)選定低 (L)、中 (M)、和高(H)3個濃度。在尋求最佳激素配比時，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡單方法。 三、逐步添加和逐步排除的試驗方法 ? 在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機營養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。因此，一次系統(tǒng)的試驗結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時間取得成倍的收獲。例如，采用正交設(shè)計，在使用此表時就可以安排 4個因子， 3種水平的試驗，一共做 9種不同搭配的試驗，其結(jié)果相當(dāng)于做了 27次種種搭配的試驗。 二、多因子試驗 ? 完全試驗方案試驗因子越多，處理數(shù)越多，試驗越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。隨試驗規(guī)模和要求不同，大多每個項目要有 4— 10瓶，每瓶至少 3塊培養(yǎng)物或 3叢小幼苗。以保證試驗結(jié)果是來源于試驗因子，而不是由于試驗材料的不一致導(dǎo)致的。 ? 生物學(xué)試驗不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗中必需設(shè)置對照組與試驗組，試驗組可以有一組或幾組，隨試驗的復(fù)雜性而設(shè)置，對照組也可能有一組以上。 一、單因子試驗 ? 在單因子試驗中．由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個因子，就可以找出這一因子對試驗的影響和影響的程度。當(dāng)通過一系列的實驗，對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實驗需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。 ? 細胞分裂素類一般先用少量 1N鹽配溶解后，再加入溫水冷卻后定容， ? 鐵鹽配法（ MS為例）：在裝有 400ml 蒸餾水的燒杯中加入2粒苛性鈉，溶解后加入 EDTANa2， 加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入 解，冷卻后定容至 500ml， 置于冰箱中備用。 2， 4— D可用O． 1mol／ L的 NaOH或 KOH助溶，加入溫水定容。一般用 a:b表示，即每 b毫升溶液中含有 a毫克溶質(zhì)。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如 Ca2+ ? 和 S042+， Ca2+、 Mg2+和 PO43 一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。一般母液配成比所需濃度高 10100倍。為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。調(diào)節(jié)時一定要充分攪拌均勻。 pH值大小調(diào)整可用 0． 1M的 NaOH和0． IM的 HCI來調(diào)整。一般來說當(dāng) pH值高于 6． 5時，培養(yǎng)基全變硬；低于 5時，瓊脂不能很好地凝固。 ? pH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。通常 1— 2個大氣壓對植物生長有促進作用， 2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而 5— 6個大氣壓植物生長就會完全停止， 6個大氣壓植物細胞就不能生存。濕度過高時，易引起棉塞長霉，造成污染。 ? 環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求 70%—80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。 濕度 (humidity) ? 濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。但在藍光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種 15d后，在藍光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。 ? 2．光質(zhì) (light wave) ? 光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 光照 (light) ? 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光照時間方面 ? 1．光照強度 (light intensity) ? 光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植體及細胞的最初分裂有明顯的影響。桃胚在 2—5℃ 條件進行一定時間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。如煙草芽的形成以28℃ 為最好，在 120℃ 以下， 33℃ 以上形成率皆最低。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同，百合的最適溫度是 20℃ 、月季足 2527℃ 、番茄是 28℃ 。 2℃ 。二 環(huán)境條件 ? 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、 pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。 溫度 (temperature) ? 因為溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在 23～ 27℃ 之間進行，一般采用 25177。低于 15℃℃ 時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于 35℃ 時對植物生長不利。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進程。 ? 不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在 30℃ 以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在 25℃ 以下的高。用35℃ 處理草莓的莖尖分生組織 3— 5d，可得到無病毒苗。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)， 8周后，分化出愈傷組織。 ? 3．光周期 (light period) ? 試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光暗周期來進行組織培養(yǎng)，最常用的周期是 16h的光照， 8h的黑暗。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。前者又受瓊脂含量的影響。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進而影響組織培養(yǎng)的正常進行。 滲透壓 (perating pressure) ? 培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。 pH值 (pH value) ? 不同的植物對培養(yǎng)基最適 pH值的要求也是不同的 (表2— 1)，大多在 6． 5左右，一般培養(yǎng)基皆要求 ，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。因為高溫滅菌會降低pH值 (約 — pH值 )因此在配制時常提高 pH值0． 2— 0． 3單位。 lml的 NaOH可使 pH值升高 0． 2單位， lml的 HCl可使 pH值降低 0． 2單位。 種類 最適 pH值 種類 最適 pH值 杜鵑 月季 越桔 胡蘿卜、石刁柏 蠶豆 桃 番茄 不同植物的最適 pH值 氧氣 (oxygen) ? 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等 第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備 ? 一、母液 (stock solution)的配制和保存 ? 在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。 母液的配制方法： ? 單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。 ? 混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用 a mg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液 a ml. ? 生長素配制時可先用少量 95%酒精助溶。生長素常配成 1mg／ ml的溶液貯于冰箱中備用。 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 ? 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基 (如 Ms培養(yǎng)基或 B5培養(yǎng)基 )開始。常用試驗方法主要有單因子試驗、多因子試驗及廣譜實驗等。例如 Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗就是單因子試驗。試驗中要求對照組與試驗組中的試驗個體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。 ? 試驗中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗結(jié)果。 2種激素 5種濃度的實驗組合 6BA mg/L） 0 5 10 NAA 0 1 2 3 4 5 (mg/L) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 ?對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進行研究的試驗稱為多因子實驗，試驗可采用完全試驗方案，也可選用正交設(shè)計方案，完全試驗方案具有均衡完全的特點，各個因子的每個水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究 NAA和 6— BA的最佳濃度組合，每個因子各設(shè) 5個濃度水平 (0， ， ， 5， 10mg／ L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個具有 25項處理的試驗見表 3— 3。為了減少試驗處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗信息，通常采用正交試驗。正交試驗雖然是多因素搭配在一起的試驗，但是在試驗結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細胞分裂素、生長素、糖和其他成分的用量。在逐步添加時是使試驗成功，在逐步減少時是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡化，以降低成本和利于推廣。 四、廣譜實驗法 ? 在廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為 4大類：無機鹽、有機營養(yǎng)物質(zhì) (蔗糖、氨基酸和肌醇等 )、生長素、細胞分裂素。 4類物質(zhì)各 3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項包括 81個處理的實驗。例如，一個包含中等濃度無機鹽，低等濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高等濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為 MLMH。這是因為不同類型的生 K素和細胞分裂素對不同植物的活性有所不同。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。依此觀點，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。茵的特點是：極小，肉眼看不見。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、等 )和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。 常用的滅菌方法 ? 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱 (烘燒和灼燒 )、濕熱 (常壓或高壓蒸煮 )、射線處理 (紫外線、超聲波、微波 )、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升