【正文】 變基因為雜合子。采用 PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ ASO） 原理： 針對已知突變位點的基因，可以分別針對已知突變位點的序列，設(shè)計一對寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無突變序列互補，另一個為突變型探針，與突變序列互補。即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。高效率的基因擴增技術(shù)直接采用 PCR技術(shù)進行基因診斷 通過 PCR技術(shù)擴增特異性的基因，可以確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)的體內(nèi)基因缺失或基因突變 采用 PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析（ PCR－ RFLP）　　基因突變導致的基因堿基組成和順序發(fā)生改變，會在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點或使原有限制性內(nèi)切酶位點消失。操作簡單、省時216。特異性強216。原位雜交 ： 在組織、細胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位 。 dot blot： 既可檢測 DNA也或檢測 RNA， 用于基因組中特定基因及其表達的定性和定量分析。探針的標記物?放射性標記物– 32P， 35S， 125I， 3H?非放射性標記物v生物素，地高辛，熒光素， 酶， 金屬Southern blotNN T T N T T Southern blot： 用于 DNA檢測，不但能檢測出特異的 DNA片段，還能進行定位和測定分子量，可用于基因的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等?；蛱结?cDNA探針 :目前應(yīng)用最廣泛的?寡核苷酸 探針 (Oligonucleotide probes)?RNA 探針 : 不同的探針在應(yīng)用中有各自的特點 ,但最重要的是探針的序列選擇 .而探針序列又是依據(jù)待測核酸序列選擇的。2．臨床意義 : ? 對有表型出現(xiàn)的疾病作出 明確診斷? 早期快速診斷? 確定個體對疾病的易感性? 疾病的分期分型、療效監(jiān)測、預后判斷等 二、基因診斷的常用技術(shù)與方法(一 ) 基因診斷的常用技術(shù)(二 ) 基因診斷的基本方法(一 )基因診斷常用技術(shù)1. 核酸分子雜交2. PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）3. 限制性酶切分析4. SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）5. DNA 測序 6. DNA 芯片技術(shù)基因診斷技術(shù)分類 Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, PCR DNA測序 DNA芯片技術(shù)1. 核酸分子雜交Molecular hybridization? Southern blot—— DNA? Northern blot—— RNA? Dot blot，? In Situ Hybridization, 核酸雜交的基本原理：利用核酸變性和復性理論：（ 1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復后又可恢復其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（ 2）具有互補堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補配對原則通過氫鍵結(jié)合為雙鏈。RNA診斷2． 基因診斷的特點：（ 1）直接檢測基因，屬病因診斷， 針對性強；（ 2）特異性強、靈敏度高： 由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（ 3）適用范圍廣： 其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。DNA診斷? ? 指利用分子生物學技術(shù)，從 DNA或RNA水平檢測 基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)， 對 疾病 作出診斷的方法和過程。第八 章 基因診斷Gene Diagnosis人類疾病的原因? 內(nèi)因： 基因結(jié)構(gòu)改變（ 基因突變 ） —— 點突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴增 基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性 基因表達異常? 外因： 病原體的侵入對于疾病的診斷依據(jù)：?臨床表現(xiàn)?實驗室診斷技術(shù)： 細胞學檢查 生物化學代謝產(chǎn)物和酶的活性變化檢查 免疫學檢驗 基因診斷一、基因診斷概述(一 ) 基因診斷的 概念與特點(二 ) 基因診斷的 基本原理 與 臨床意義(一 )基因診斷的概念與特點1．概念：? 基因診斷以 DNA和 RNA為診斷材料， 基因診斷的評價?特異性?靈敏度?重復性?快速?經(jīng)濟(二 )基因診斷的基本原理與臨床意義 1．基本原理： 通過檢測 致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因） 的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否及表達水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。核酸分子雜交的流程示意圖? 待測核酸制備濾膜上核酸 固化雜 交去除未參與雜交的探針檢 測 雜 交 信 號? 制備探針核酸片段探 針 標 記加入標記核酸探針探針的種類?DNA 探針 :基因組 DNA探針 ?！　χ虏⌒晕⑸飸?yīng)選用其最保守、最特異的序列；對突變基因的檢測，應(yīng)用含有突變位點的序列或待測基因編碼的ｍＲＮＡ序列。 Northern blot： 雜交用于 RNA檢測，能對組織細胞中的總 RNA或 mRNA進行定性和定量分析。缺點：特異性較低，不能鑒定所分析的基因分子量。PCR是在試管內(nèi)利用 DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復進行同一段 DNA片段合成的過程（二） PCR技術(shù)是基因診斷的一種 基礎(chǔ) 技術(shù)PCR技術(shù)的優(yōu)點216。靈敏度高216。對待檢原始材料質(zhì)量要求低216。因此，突變基因經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷突變是否存在?！　?PCR－ RFLP就是利用 PCR技術(shù)先將包含待測位點的DNA片段擴增出來，然后用識別該位點的限制性內(nèi)切酶水解，根據(jù)限制性片段數(shù)量和長度作出診斷。同時設(shè)計探針時，突變堿基應(yīng)位