基因診斷-腫瘤的分子診斷(已修改)
2025-01-15 18:06 本頁(yè)面
【正文】 第八 章 基因診斷Gene Diagnosis人類疾病的原因? 內(nèi)因： 基因結(jié)構(gòu)改變（ 基因突變 ） —— 點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增 基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性 基因表達(dá)異常? 外因： 病原體的侵入對(duì)于疾病的診斷依據(jù)：?臨床表現(xiàn)?實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)： 細(xì)胞學(xué)檢查 生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶的活性變化檢查 免疫學(xué)檢驗(yàn) 基因診斷一、基因診斷概述(一 ) 基因診斷的 概念與特點(diǎn)(二 ) 基因診斷的 基本原理 與 臨床意義(一 )基因診斷的概念與特點(diǎn)1．概念：指利用分子生物學(xué)技術(shù)，從 DNA或RNA水平檢測(cè) 基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)， 對(duì) 疾病 作出診斷的方法和過(guò)程。? 基因診斷以 DNA和 RNA為診斷材料， ? DNA診斷? RNA診斷2． 基因診斷的特點(diǎn)：（ 1）直接檢測(cè)基因，屬病因診斷， 針對(duì)性強(qiáng)；（ 2）特異性強(qiáng)、靈敏度高： 由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（ 3）適用范圍廣： 其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。 基因診斷的評(píng)價(jià)?特異性?靈敏度?重復(fù)性?快速?經(jīng)濟(jì)(二 )基因診斷的基本原理與臨床意義 1．基本原理： 通過(guò)檢測(cè) 致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因） 的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否及表達(dá)水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。2．臨床意義 : ? 對(duì)有表型出現(xiàn)的疾病作出 明確診斷? 早期快速診斷? 確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性? 疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等 二、基因診斷的常用技術(shù)與方法(一 ) 基因診斷的常用技術(shù)(二 ) 基因診斷的基本方法(一 )基因診斷常用技術(shù)1. 核酸分子雜交2. PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）3. 限制性酶切分析4. SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）5. DNA 測(cè)序 6. DNA 芯片技術(shù)基因診斷技術(shù)分類 Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, PCR DNA測(cè)序 DNA芯片技術(shù)1. 核酸分子雜交Molecular hybridization? Southern blot—— DNA? Northern blot—— RNA? Dot blot，? In Situ Hybridization, 核酸雜交的基本原理：利用核酸變性和復(fù)性理論：（ 1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（ 2）具有互補(bǔ)堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則通過(guò)氫鍵結(jié)合為雙鏈。核酸分子雜交的流程示意圖? 待測(cè)核酸制備濾膜上核酸 固化雜 交去除未參與雜交的探針檢 測(cè) 雜 交 信 號(hào)? 制備探針核酸片段探 針 標(biāo) 記加入標(biāo)記核酸探針探針的種類?DNA 探針 :基因組 DNA探針 ?；蛱结?cDNA探針 :目前應(yīng)用最廣泛的?寡核苷酸 探針 (Oligonucleotide probes)?RNA 探針 : 不同的探針在應(yīng)用中有各自的特點(diǎn) ,但最重要的是探針的序列選擇 .而探針序列又是依據(jù)待測(cè)核酸序列選擇的?！ ?duì)致病性微生物應(yīng)選用其最保守、最特異的序列；對(duì)突變基因的檢測(cè)，應(yīng)用含有突變位點(diǎn)的序列或待測(cè)基因編碼的ｍＲＮＡ序列。探針的標(biāo)記物?放射性標(biāo)記物– 32P， 35S， 125I， 3H?非放射性標(biāo)記物v生物素，地高辛，熒光素， 酶， 金屬Southern blotNN T T N T T Southern blot： 用于 DNA檢測(cè)，不但能檢測(cè)出特異的 DNA片段，還能進(jìn)行定位和測(cè)定分子量，可用于基因的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等。 Northern blot： 雜交用于 RNA檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中的總 RNA或 mRNA進(jìn)行定性和定量分析。 dot blot： 既可檢測(cè) DNA也或檢測(cè) RNA， 用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析。缺點(diǎn)：特異性較低，不能鑒定所分析的基因分子量。原位雜交 ： 在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位 。PCR是在試管內(nèi)利用 DNA聚合酶催化的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行同一段 DNA片段合成的過(guò)程（二） PCR技術(shù)是基因診斷的一種 基礎(chǔ) 技術(shù)PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)216。特異性強(qiáng)216。靈敏度高216。操作簡(jiǎn)單、省時(shí)216。對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低216。高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)直接采用 PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷 通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性的基因，可以確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)的體內(nèi)基因缺失或基因突變 采用 PCR產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（ PCR－ RFLP） 基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成和順序發(fā)生改變，會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消失。因此，突變基因經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會(huì)發(fā)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷突變是否存在。即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)?！ ?PCR－ RFLP就是利用 PCR技術(shù)先將包含待測(cè)位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)，然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶水解，根據(jù)限制性片段數(shù)量和長(zhǎng)度作出診斷。采用 PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ ASO） 原理： 針對(duì)已知突變位點(diǎn)的基因，可以分別針對(duì)已知突變位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與
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