基因診斷-腫瘤的分子診斷-wenkub
2023-01-26 18:06:58 本頁面
【正文】 致病基因（包括內(nèi)源基因與外源基因） 的存在、量的多少，結(jié)構(gòu)變化與否及表達(dá)水平是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。? 基因診斷以 DNA和 RNA為診斷材料， 第八 章 基因診斷Gene Diagnosis人類疾病的原因? 內(nèi)因： 基因結(jié)構(gòu)改變（ 基因突變 ） —— 點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增 基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性 基因表達(dá)異常? 外因： 病原體的侵入對于疾病的診斷依據(jù)：?臨床表現(xiàn)?實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)： 細(xì)胞學(xué)檢查 生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶的活性變化檢查 免疫學(xué)檢驗(yàn) 基因診斷一、基因診斷概述(一 ) 基因診斷的 概念與特點(diǎn)(二 ) 基因診斷的 基本原理 與 臨床意義(一 )基因診斷的概念與特點(diǎn)1．概念：DNA診斷? 2．臨床意義 : ? 對有表型出現(xiàn)的疾病作出 明確診斷? 早期快速診斷? 確定個體對疾病的易感性? 疾病的分期分型、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等 二、基因診斷的常用技術(shù)與方法(一 ) 基因診斷的常用技術(shù)(二 ) 基因診斷的基本方法(一 )基因診斷常用技術(shù)1. 核酸分子雜交2. PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）3. 限制性酶切分析4. SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）5. DNA 測序 6. DNA 芯片技術(shù)基因診斷技術(shù)分類 Molecular hybridization： Southern, Northern, dot blot, PCR DNA測序 DNA芯片技術(shù)1. 核酸分子雜交Molecular hybridization? Southern blot—— DNA? Northern blot—— RNA? Dot blot，? In Situ Hybridization, 核酸雜交的基本原理：利用核酸變性和復(fù)性理論：（ 1）雙鏈DNA分子在某些理化因素作用下解旋，條件恢復(fù)后又可恢復(fù)其雙螺旋結(jié)構(gòu)；（ 2）具有互補(bǔ)堿基序列的異源核酸單鏈之間同樣可按堿基互補(bǔ)配對原則通過氫鍵結(jié)合為雙鏈。探針的標(biāo)記物?放射性標(biāo)記物– 32P， 35S， 125I， 3H?非放射性標(biāo)記物v生物素，地高辛，熒光素， 酶， 金屬Southern blotNN T T N T T Southern blot： 用于 DNA檢測，不但能檢測出特異的 DNA片段，還能進(jìn)行定位和測定分子量，可用于基因的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等。原位雜交 ： 在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位 。操作簡單、省時216。即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。 PCR/ASO則是采用 PCR擴(kuò)增受檢者基因的目標(biāo)片段，并與相應(yīng)的 ASO探針雜交，如果受檢者 DNA擴(kuò)增的產(chǎn)物與正常探針雜交，而不與突變探針雜交，表示受檢者不存在突變基因；如果只有突變探針可以雜交，說明突變基因?yàn)榧兒献樱蝗绻麅烧叨即嬖冢瑒t說明突變基因?yàn)殡s合子。 DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈 DNA會因其分子內(nèi)堿基之間的相互作用，形成一定的立體構(gòu)象。 該技術(shù)是先制備濃度從低到高的變性劑的凝膠，然后將待測分析的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，到 DNA電泳到變性劑濃度能使 DNA發(fā)生變性的位置時， DNA雙鏈分開，由于不同 DNA片段的堿基組成不同，因此在凝膠中泳動發(fā)生變性的位置不同，遷移率也不同，因此可以將相同長度但堿基組成不同的 DNA片段分開，從而能檢測出基因的突變。甲基化特異性 PCR技術(shù) 將 DNA先用亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的 PCR。?PCR定量分析方法有： 梯度（系列）稀釋法、 極限稀釋法、非競爭性對照法、競爭抑制法 、 熒光定量 PCR采用 PCR技術(shù)進(jìn)行靶核酸的定量分析PCR擴(kuò)增有限性 平臺期及平臺效應(yīng)（ plateauPCR擴(kuò)增的平臺效應(yīng)梯度（系列）稀釋法：161。優(yōu)點(diǎn)：簡單，可作粗糙的定量分析。然后對該稀釋系列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增測定 。 競爭 PCR 與前述方法相似，即靶基因與參考標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，但參照標(biāo)準(zhǔn)通常是一段人工合成的模板而不是內(nèi)源性基因。 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息第二節(jié)對不同疾病采用不同基因診斷的策略 人類疾病多種多樣，致病原因不同，因此在基因診斷上也有不同途徑和策略。 如：用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，利用該遺傳標(biāo)記與相鄰的基因在遺傳過程中分離幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖特點(diǎn)，建立了染色體基因連鎖圖，根據(jù)基因連鎖圖，通過分析連鎖基因的遺傳標(biāo)記，可判斷致病基因存在的可能性。原理：從分析正常和異?；蚪M采用差異顯示等技術(shù)找到正常人和疾病患者之間的差異序列，進(jìn)行克隆。第三節(jié) 基因診斷的應(yīng)用前景 RFLP分析（ 20世紀(jì) 80年代 ）基因診斷的發(fā)展歷史第三節(jié) 基因診斷的應(yīng)用前景基因診斷過程中存在的問題 遺傳病的基因診斷是在基因水平上對核酸堿基序列突變的檢測，從遺傳物質(zhì)的分子水平上揭示疾病的發(fā)生原因和分子機(jī)制。第四節(jié) 遺傳病的基因診斷第四節(jié) 遺傳病的基因診斷直接診斷：檢測已知致病基因? ：? （ 1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變 直接診斷：檢測已知致病基因? 血紅蛋白病可以由血紅蛋白結(jié)構(gòu)或合成異常所致的遺傳性疾病。鐮狀紅細(xì)胞貧血 HBSBeta株蛋白基因突變：5180。突變基因鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCRRE分析 MstII
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