【正文】 p)目 錄目 錄左側(cè)：正常；右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究目 DNA序列測(cè)定（ DNA錄A B C D E F G－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－ ＋C +DAEcoR目 polymorphism,錄目 目 polymorphism,錄目 多重 PCR 多重 PCR示意圖 A：普通 PCR； B：多重 PCR目 熒光定量 PCR熒光標(biāo)記引物目 錄1.Taq DNA聚合酶變性延伸 退火目 chain目 6.錄目 錄熒光原位雜交（ FISH）目 (FISHhybridization,oligonucleotide,寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對(duì)正常和突變ASO探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交，檢測(cè)點(diǎn)突變， 大大提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。錄先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品 RNA或 DNA標(biāo)記變性后進(jìn)行雜交。dot將 RNA或 DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。blotting）blotting)目 錄目 1.錄目 錄（一）核酸分子雜交 Nucleicblotting ） n DNA序列測(cè)定（ DNAhybridization） 應(yīng)用廣泛性目 錄目 錄基因診斷的特點(diǎn)252。基因診斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是 DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對(duì)一例 α地中海貧血進(jìn)行診斷。錄目 錄第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)Basis of Gene Diagnostics目 目 錄目 錄基因診斷之父 — 簡(jiǎn)悅威目 目 高特異性252。錄目 n 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)sequencing） n 生物芯片（ biochips） n 免疫組織化學(xué)診斷 acid錄核酸分子雜交流程 待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測(cè)雜交信號(hào)核酸探針制備探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針目 Southern錄RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測(cè)特定的 mRNA分子的含量與大小。錄目 目 blotting）改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率 。等位基因特異性寡核苷酸ASO）目 FISH）n 掛鎖 FISHwith錄目 固相夾心雜交法(sandwich錄目 reaction,錄目 錄目 錄目 錄（三） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（ singlestrandSSCP）錄目 錄PCRSSCP分析原理示意目 錄 （四）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 （ restrictionRFLP）由于 DNA錄目 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在 PCR擴(kuò)增后用該限制酶切割 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。Ⅰ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化目 sequencing）目 錄目 錄目 錄目 錄（一）直接診斷途徑 必要條件：◆ 被檢測(cè)基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系◆ 被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定◆ 被檢基因致病的分子機(jī)制（突變位點(diǎn)或表達(dá)變化）已知目 PCRASO、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序5/——5 /—3 /3/—（ 2）無限制性酶切位點(diǎn)改變 目 2. 基因重排的檢測(cè)核酸分子探針雜交與 PCR錄目 specificmRNA的相對(duì)定量分析錄目 錄多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。VNTRtandem(shortnucleotide錄目 （一）鐮狀細(xì)胞貧血病 二、血友病（ Hemophilia） 目 錄目 ACTAAGn 突變的（ M）的 ASO探針：CCTTCT錄斑點(diǎn)雜交結(jié)果 N：正常； M突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者 ASO雜交法檢測(cè)NASOMASO正常 突變 突變純合子 雜合子 純合子5180。(CCT GTG G)鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析MstⅡ 酶切位點(diǎn) （ CCTNAGG）2.錄目 錄3.錄1.I。bA；4： bT/bp的片段太小，在 ％的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二） ?珠蛋白生成障礙性貧血癥目 n 甲型血友病的基因突變類型已有 300余種，其中點(diǎn)突變占 174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子 22的基因倒位所致。FVIII基因倒位的 DNA印跡分析I或 Bclkb三種類型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。錄2.Xn 正常人中約為 島未被甲基化，稱為前突變（ premutation）。n 全突變可關(guān)閉相鄰 FMR1基因的表達(dá)， FMR1錄脆性 X綜合征常用基因診斷方法1． PCRASO 第三節(jié) 傳染病的基因診斷 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目 DNA，以便分型。錄二、細(xì)菌引起的疾病n 結(jié)核分枝桿菌 先設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用 PCR技術(shù)擴(kuò)增出一 383錄三、寄生蟲及衣原體感染n 瘧原蟲 診斷方法：核酸雜交和 PCR技術(shù)錄目 錄錄3．抑癌基因 p53的檢測(cè) n p53的基因診斷方法有乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的 BRCA基因（ breastBRCA1在 N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；而在 C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。二、常見腫瘤的基因診斷目 錄（二）結(jié)腸癌 Kras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。of錄目 錄n 重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。重復(fù)單位 2～ 6錄目 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列 (VNTR)目 DNA長(zhǎng)度多態(tài)除可用 Southern印跡雜交法檢測(cè)外，還可以通過 PCR擴(kuò)增后電泳來檢出。polymorphism, 錄目 目 錄1．單位點(diǎn)探針檢測(cè)及 PI值的計(jì)算目 多位點(diǎn) VNTR系統(tǒng)和 DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計(jì)算復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別時(shí)匹配概率的計(jì)算影響因素較多，目前尚無一個(gè)公認(rèn)的最合理的計(jì)算方法。目前解決親權(quán)糾紛最簡(jiǎn)單的辦法是先在孩子 DNA指紋圖中找出非母片段并計(jì)數(shù)為 P，然后分析爭(zhēng)議父 DNA指紋圖，看 P條非母帶在爭(zhēng)議父中出現(xiàn)多少條。 錄 狹義基因治療： 指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。錄目 生殖細(xì)胞 (germline)基因治療v 只限于某一體細(xì)胞的基因的改變v 只限于某個(gè)體的當(dāng)代v 對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正v 當(dāng)代及子代目 目的： 將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換。錄（二） 基因添加 （ gene目 目 Gene單純皰疹病毒（ herpskinase,錄旁觀者效應(yīng)（ bystander目 錄 病毒載體 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。錄p 兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列 LTR。p 病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因p 5ˊ端 LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ ψ）及剪接供體位點(diǎn) (SD)和剪接受體位點(diǎn) (SA)。l gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；l pol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；l env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 )?！?由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體： 其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號(hào) ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。 錄Retroviral① 反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上 env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。② 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因 gag、 env和 pol的缺失不影響其他部分的活性。③ 前病毒通過 LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。④ 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納 7腺病毒是一種大分子 (36 kb外源基因。 目 其基因組 DNA小于 5VirusAAVCAP：編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復(fù)序列目 AAV可以高效定點(diǎn)整合至人 19號(hào)染色體的特定區(qū)域 ，并能較穩(wěn)定地存在。kb外源 DNA片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低 ,在 40% ~80% 的成人中存在過感染 。 整合 致病性 感染細(xì)胞 克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒 載體隨機(jī)整合，效率高可能致病 分裂細(xì)胞 7kb腺病毒載體 不整合，可能丟失不致病 分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞錄目 這種偶聯(lián)通