【正文】 0μl【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】四、DNA片段回收及與載體連接【目的要求】掌握DNA片段回收及與載體連接的方法及原理。設(shè)定PCR程序，把樣品放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。藥品 Taq酶、10x擴(kuò)增緩沖液、dNTP、正向引物（10pmol/μl,溶于無(wú)菌水中，貯于20℃）、反向引物（10pmol/μl,溶于無(wú)菌水中，貯于20℃）、無(wú)菌水、50xTAE、EB、加樣緩沖液。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍?！净驹怼? 類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 當(dāng)DNA 樣品在凝膠中遷移足夠距離時(shí)，關(guān)上電源并取出樣品放入事先配好的EB 溶液中染色5～7min(EB 見光分解，應(yīng)置于暗室中)，在紫外分析儀上觀察并可用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍攝。膠越長(zhǎng)，電壓越低，DNA 片段越大，所需時(shí)間就越長(zhǎng)。若電極插頭連接正確，陽(yáng)極和陰極由于電解作用將產(chǎn)生氣泡。DNA 應(yīng)向陽(yáng)極(紅色插頭)側(cè)泳動(dòng)。 取適量的DNA 樣品與10加樣緩沖液混合，然后用移液槍將樣品加入樣品孔內(nèi)。小心拔出梳子，將凝膠安放到電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極(黑末端)。 待凝膠稍微冷卻后，將膠緩慢倒入模具中，膠厚度以3～5mm 為宜?！痉椒ú襟E】將瓊脂糖電泳的磨具置一個(gè)水平臺(tái)上。 溴化乙錠(EB)貯存液(10mg/mL)：在100mLH2O中加入1g溴化乙錠用磁力攪拌器攪拌幾個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至棕色瓶中，4℃貯存(溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，稱量時(shí)需要戴手套和口罩，萬(wàn)一接觸了溴化乙錠，立即用大量的水沖洗)?！緦?shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)提取的DNA器材刻度量筒、玻璃棒、三角燒瓶、移液槍及槍頭、微波爐或沸水浴、凝膠灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝膠樣品梳、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電源等。具有相同一級(jí)結(jié)構(gòu)但構(gòu)型不同的DNA 分子也可以通過這種方法進(jìn)行分離。一般情況下，單位長(zhǎng)度雙鏈DNA 帶有幾乎相等的電荷，故在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于凝膠的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和構(gòu)型?！痉椒ú襟E】取冷凍保存或新鮮的植物材料，液氮下研磨，加入500μl DNA提取緩沖液，65℃水浴1hr‘每隔15min上下顛倒一次；從水浴中取出后，冷卻至室溫，加入500μl 24：1 氯仿：異戊醇，上下輕柔顛倒混勻；12,500rpm離心5分鐘，取上清，加入500μl 24：1 氯仿：異戊醇，上下輕柔顛倒混勻；如果中間層蛋白質(zhì)過多，重復(fù)步驟2；12,500rpm離心5分鐘，取上清，冰箱冷藏沉淀30分鐘；12,500rpm離心5分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12,500rpm收集沉淀；干燥沉淀，用50μl 含有RnaseA的TE溶解沉淀；【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】 二、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段1【目的要求】學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的方法和技術(shù)【基本原理】瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是DNA 分子片段的分子量測(cè)定和分子構(gòu)象研究以及DNA 分離純化的重要實(shí)驗(yàn)手段。 【實(shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料幼嫩葉子器材移液器，臺(tái)式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽， 。再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院生物系基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)手冊(cè)目錄一、植物DNA的提取 2二、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段 4三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段 6四、DNA片段回收及與載體連接 8五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化 10六、堿裂解法小量提取質(zhì)粒及質(zhì)粒酶切 12七、細(xì)胞特異性染色 15八、動(dòng)物細(xì)胞的基本形態(tài)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù) 19九、細(xì)胞凝集反應(yīng)和細(xì)胞膜通透性的觀察 23十、線粒體和液泡的超活染色與觀察 26十一、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合 28十二、細(xì)胞骨架系統(tǒng)的顯示與觀察 30十三、植物細(xì)胞的有絲分裂染色體標(biāo)本制片及觀察 33十四、蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù) 36一、植物DNA的提取【目的要求】學(xué)習(xí)提取和純化高等植物總DNA的方法，理解其原理?！净驹怼客ǔ２捎脵C(jī)械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞，由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對(duì)DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。 十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡(jiǎn)稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡(jiǎn)稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來(lái)。上清液中加入無(wú)水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。 藥品2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4g NaCl g 1M TrisHCl 20ml( ) EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, % 2巰基乙醇 （400ul） 24：1/氯仿:異戊醇 RnaseA母液 其它試劑：異丙醇、TE緩沖液，無(wú)水乙醇、70%乙醇。DNA 分子在瓊脂糖凝膠電泳中泳動(dòng)時(shí)受到電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力和凝膠的摩擦阻力。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，具有不同長(zhǎng)度的DNA 片段由于其泳動(dòng)速度不同而得到分離。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，在紫外光照射下可發(fā)出波長(zhǎng)590nm 的紅色熒光，DNA 分子與EB 形成熒光絡(luò)合物后，其發(fā)射的熒光比原來(lái)要增強(qiáng)數(shù)十倍，常用來(lái)觀察凝膠中DNA 條帶的位置。藥品瓊脂糖凝膠(～%，瓊脂糖粉末與1TAE 配成)，TAE(Tris乙酸鹽，EDTA)電泳緩沖液[50濃縮貯存液：Tris 堿242g；； mol/L EDTA ()，100mL；加600mL、蒸餾水，劇烈攪拌，加蒸餾水至1000mL，]。 10加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)、%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、%SDS。 根據(jù)被分離DNA 片段的大小用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液：應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉將其加入到盛有已定量電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒攪拌均勻后放入沸水浴或微波爐中加熱至瓊脂糖熔化。 讓凝膠溶液完全凝結(jié)，室溫下30～45min，待膠略凝結(jié)時(shí)放入4℃冰箱可大大縮短凝結(jié)時(shí)間。 向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm。 加樣完畢后，關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭。給予1～5V/cm 的電壓，其中距離以陽(yáng)極至陰極之間的測(cè)量為準(zhǔn)。 電泳時(shí)間的選擇取決于膠的長(zhǎng)度、電壓和DNA 片段的大小。然而使用高壓時(shí)，大的DNA 片段的分辨率很低，電泳出的條帶不清晰?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段【目的要求】 掌握PCR實(shí)驗(yàn)的操作方法，并理解其原理。PCR由變性退火(復(fù)性）延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板?！緦?shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料第一次實(shí)驗(yàn)提取的DNA器材PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、PCR管、凝膠灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝膠樣品梳、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電源等?！痉椒ú襟E】在PCR管中加入適量緩沖液、模板DNA、dNTP,正向引物、反向引物和Taq酶，將上述物質(zhì)混合均勻后，短暫離心收集于管底。擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果?！净驹怼抠|(zhì)粒、噬菌體等經(jīng)酶切，電泳；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，常常需要對(duì)一些DNA電泳片段進(jìn)行回收和純化，用于亞克隆、探針標(biāo)記等。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA，快速，而且回收率高。某些PCR產(chǎn)物3’端帶有一個(gè)凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3’端帶有凸出的dTMP的載體。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成加T反應(yīng)。如果使用ddTTP，效果會(huì)更好。【實(shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)的PCR產(chǎn)物。藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T載體連接試劑盒、無(wú)水乙醇，無(wú)菌水。加入3倍體積的溶膠液（每100mg凝膠加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上。向吸附柱中加入700μl Buffer 漂洗液， 13000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。將離心吸附柱放回收集管中， 13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50μl 6570℃預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置2min，13,000rpm離心2分鐘收集DNA溶液。將回收產(chǎn)物按照T載體連接試劑盒說(shuō)明書與T載體進(jìn)行連接?！净驹怼克^感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。其基本原理是：細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會(huì)膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗DNase的羥基鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過42℃短時(shí)間的熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。儀器與耗材恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺(tái)式高速離心機(jī),無(wú)菌工作臺(tái),低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計(jì),微量移液槍； Eppendorf 管、tip頭 、燒杯、量筒。藥品LB培養(yǎng)基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，瓊脂粉 15g/L（固體培養(yǎng)基）；氨芐青霉素貯存液：濃度50100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培養(yǎng)基：將配置好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到60度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50181。