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正文內(nèi)容

臨床生化檢驗基礎(chǔ)知識培訓(xùn)-展示頁

2025-07-07 17:32本頁面
  

【正文】 : 同一項目最多可加入四步試劑,兩試劑艙位置各45個,溫度5~15℃。二、生化儀器基礎(chǔ)知識:l 日立:7100、7170、7080、7180、7600,l 奧林巴斯:AU400、AU6AU2700、AU5400l 貝克曼:CXLXDXC800,AU480,AU680,AU5800l 東芝:TBATBA120l 雅培:2000、C8000、AEROSETl 拜爾:ADVIA1200、ADVIA1650、ADVIA2400 l 日立:現(xiàn)在各醫(yī)院所用日立儀器的型號主要為7180、7600,除7080為31個測光點外,其余都為34點。只循環(huán)靶物質(zhì),減少了樣品存在的其他物質(zhì)對測定的干擾,因此不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或?qū)Π形镔|(zhì)進(jìn)行提取,而且不需要特殊設(shè)備,是一種很有前途的測定技術(shù)。此外,被測非酶物質(zhì)作為酶促反應(yīng)激活劑者,則用連續(xù)監(jiān)測法,如無機(jī)離子鉀和鈣的酶法測定。酶對底物的 Km 要高,以便測出較寬范圍的底物濃度。必須用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正。在反應(yīng)過程中的兩個固定時間,測量與底物濃度性質(zhì)相關(guān)的(如光吸收)的方法為兩點動力學(xué)法。這是一級反應(yīng)的通性。對于任何一級反應(yīng),反應(yīng)開始后在一給定時間 t 的底物濃度 (S) 為:(S) =(So)*ekt (So) 是最初的底物濃度,e 是自然對數(shù)的底,K 是速率常數(shù)。第二種方法是動力學(xué)法,即間隔一定的時間測定底物的變化量(=速率)。此時需增加酶或非酶的反應(yīng),以轉(zhuǎn)變或捕獲第一個反應(yīng)的產(chǎn)物,使反應(yīng)在所要求的方向上進(jìn)行到完全。這是最理想的分析類型。(一) 傳統(tǒng)的酶法分析非酶物質(zhì)方法以酶作試劑進(jìn)行分析的方法有兩種。如用己糖激酶 (HK) 法測葡萄糖,HK 也作用于果糖產(chǎn)生相應(yīng)的 6磷酸醋。在以酶作分析試劑測定某物質(zhì)時,也可用偶聯(lián)反應(yīng)。但實際上不能都如此。具有絕對特異性的酶,即只作用于某一種物質(zhì)的酶,特別適合分析用。不需要先將測定的物質(zhì)分離和提純。由于光度計及方法學(xué)的改進(jìn),可以縮短孵育時間,增加酶活力測定范圍,縮短延遲期,增加線性期,使固定時間法仍發(fā)揮重要作用;尤其在中小醫(yī)院實險室中更有實用價值,甚至一部分生化分析儀也采用了固定時間法。兩點測定法也應(yīng)屬于酶動力學(xué)測定方法,但動力學(xué)測定法這一術(shù)語,習(xí)慣上僅指多點測定的動力學(xué)方法,即所謂速率法或連續(xù)監(jiān)測法,不論用手工法或自動法。兩點測定法是在反應(yīng)開始及反應(yīng)經(jīng)一定時間后,分別測兩點的吸光度,根據(jù)兩點間吸光度的差值,推算酶的活力。(二)固定時間法和連續(xù)監(jiān)測法 在我國臨床實驗室中,目前測定酶活性的方法,已從手工操作的固定時間法及兩點測定法過渡到連續(xù)監(jiān)測法。在正常測定中,為了能縮短延遲期和延長線性期,不僅要適量的底物濃度,還要在試劑中加入某些激活劑和其他的輔助因子。否則表觀的反應(yīng)速率將不正比于酶濃度。最后,當(dāng)?shù)孜锲鸨M或達(dá)到平衡時,反應(yīng)停止。緊跟著是反應(yīng)速率持續(xù)下降,進(jìn)入速度依賴于底物濃度的一級反應(yīng)期。此期底物也下降,但實際上反應(yīng)速度與底物濃無關(guān),對底物濃度而言,酶促反應(yīng)實際上是零級反應(yīng)。此期從幾秒到幾分鐘。典型的酶反應(yīng)過程曲線分為幾個時期。(一) 酶促反應(yīng)的過程 通過測定底物濃度的下降,或測定產(chǎn)物濃度的上升,可以追蹤酶反應(yīng)過程中底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的過程。 酶的含量很低,除免疫學(xué)方法外,不能直接測定其含量,只能測其催化反應(yīng)過程中一定時間內(nèi)物質(zhì)變化的量,即酶促反應(yīng)速率,或稱酶的活力。酶促反應(yīng)中所指速度是初速度,因為這時的反應(yīng)速度與酶濃度成正比,可以避免產(chǎn)物及其他因素對反應(yīng)速度的影響。:包括:酶的濃度、底物的濃度、激活劑與抑制劑、pH 和溫度等。酶的催化效率高,對底物有嚴(yán)格的選擇性,酶非常不穩(wěn)定,酶濃度的變化是許多疾病的敏感指針,這是建立和發(fā)展診斷酶學(xué)的依據(jù)。:酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生并能在體內(nèi)起催化作用的,一類特殊蛋白質(zhì)。 醫(yī)學(xué)決定水平與參考區(qū)間的區(qū)別在于,它不僅對健康人的數(shù)值進(jìn)行研究,以決定健康人的范圍,同時還對有關(guān)疾病的不同病情的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究,以定出不同的決定性限值,以引導(dǎo)醫(yī)生采取不同的臨床措施。決定性水平是一個閥值,高于該值或低于該值,應(yīng)決定對患者采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧? 醫(yī)學(xué)決定水平是由Barnett于1968年首先提出的。因此,假性結(jié)果是避免不了的。2s)即為參考區(qū)間的上、下限,少數(shù)用百分位數(shù)來制定參考區(qū)間。校準(zhǔn)類型:空白定標(biāo):以水做標(biāo)準(zhǔn)液,消除試劑本身對測試的干擾;(酶類) 兩點定標(biāo):以水作為零點,標(biāo)準(zhǔn)液作為另一點,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;(Y=AX+B)多點定標(biāo):兩個以上的標(biāo)準(zhǔn)液建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線;( LOGITLOG ): 臨床實驗室檢驗結(jié)果對被檢驗者低正常還是異常,有何臨床意義,如何用檢驗結(jié)果協(xié)助臨床醫(yī)生診斷和治療,這就涉及到參考區(qū)間和醫(yī)學(xué)決定水平了。因此,靈敏度與線性的評價,要根據(jù)其醫(yī)學(xué)決定水平而定。假設(shè)謀項目的醫(yī)學(xué)決定水平在0~100,如果1個單位濃度變化能引起儀器吸光度響應(yīng)量為1000,那么它能測的濃度范圍為0~35,可以看出,雖然其靈敏度很高,但在其檢測范圍沒有達(dá)到其醫(yī)學(xué)決定水平,即線性范圍太窄。靈敏度與線性范圍的取舍就要根據(jù)其醫(yī)學(xué)決定水平而定。又稱分析靈敏度。9參考物的量值溯源性:通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈,使測量結(jié)果或測量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn),通常是與國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來的特性。單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)并不阻礙光線透過,兩個及其兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過的光減少,其減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比,即與待測抗原量呈正比,由此可檢測樣本中的特定抗原含量。該法須做多點校準(zhǔn),再經(jīng)非線性回歸,求出抗原或抗體的含量。兩時間點的吸光度變化之差,則為特異反應(yīng)肌酐濃度。采用此方法的如肌酐(苦味酸法),目前多數(shù)自動分析儀還是用 Jaffe 氏反應(yīng)測肌酐,即肌酐能同堿性苦味酸鹽生成紅橙色化合物,這個反應(yīng)特異性不高,因為維生素 C 、丙酣酸、丙酣、葡萄糖、乙酷醋酸、果糖、氨基馬尿酸、蛋白質(zhì)及其他反應(yīng)產(chǎn)物亦能與堿性苦位酸鹽生成紅色化合物,血清中的這些假肌酐約含25%。因此其測光點一般要求取在反應(yīng)達(dá)到平衡前。隨酶促反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,底物不斷消耗,酶促反應(yīng)條件逐漸變化,酶促反應(yīng)速度逐漸減慢,產(chǎn)物生成或底物減少量的變化曲線遂趨平坦,這一時期稱為一級反應(yīng)期。當(dāng)酶促反應(yīng)剛一開始,底物處于過量狀態(tài),酶與底物開始結(jié)合,生成復(fù)合物 (ES) ,底物濃度開始下降,此時產(chǎn)物尚未生成。6續(xù)監(jiān)測法:也叫速率法,此法通過測定酶所催化的反應(yīng)速度,間接計算出酶的含量,稱酶活性測定法。一般是在一定溫度下,試劑與樣品經(jīng)過一定反應(yīng)時間,被送人比色系統(tǒng),然后檢測吸光度的變化,由微機(jī)系統(tǒng)處理計算和打印顯示出結(jié)果。5終點法 :這是最常用的分析法。4樣品空白:在各特定波長下,光通過以生物樣品和相應(yīng)測定項目不含有引起反應(yīng)的一種或多種成分的試劑構(gòu)成的反應(yīng)體系所測得的吸光度值。2反應(yīng)杯空白:在特定波長下,光通過以蒸餾水或空氣為反應(yīng)體系所測得的吸光度值。主波長是指測定某物質(zhì)時,生成的產(chǎn)物顏色對光吸收的特有波長。:臨床化學(xué)自動分析儀所涉及的測定方法包括終點測定法、連續(xù)監(jiān)測法、固定時間法等。目前,多數(shù)光度計設(shè)有兩個樣品室,對有熒光試樣可置于離檢測器較遠(yuǎn)的樣品室,或在光路中插入適當(dāng)?shù)臑V光片以消除熒光效應(yīng)。由于多數(shù)顯色體系熒光效應(yīng)很小,而且熒光發(fā)射是各向同性,只有一部分沿透射光方向進(jìn)入檢測器,使測量吸光度偏低。因此,免疫比濁法常用多點校準(zhǔn)來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。4非吸收作用引起的誤差::光吸收定律只適用于均勻的吸收體系,如待測溶液是混濁的,當(dāng)光通過時,將產(chǎn)生散射效應(yīng)。定性分析時,為提高分辨能力常采用較小的狹縫,而定量分析時,在靈敏度允許的情況下,宜采用較大狹縫。主要來源于儀器色散元件表面的散射、單色器內(nèi)壁塵埃等。偏離 LambertBeer定律的因素:1復(fù)合光對Beer 定律的偏離:吸收定律要求入射光為單色光,而分光光度計單色光的純度主要決定于色散元件及光路設(shè)計,即使高精度的儀器,也得不到純單色光,而是波長寬度的復(fù)合光,其結(jié)果導(dǎo)致偏離Lambert Beer 定律。摩爾吸收系數(shù)ε 表示物質(zhì)對某一波長的輻射的吸收特性。當(dāng)濃度的單位為 mol/L時,K 的單位為L/molb為液層厚度,單位為cm。:1 試劑外觀2批間差3準(zhǔn)確度4精密度5線性(靈敏度)6抗干擾能力(特異性)7穩(wěn)定性(朗伯比爾定律):A=Kbc 式中,A 為吸光度。風(fēng)濕、離子amp。,包括:人體血清(主要)、血漿及尿液中的各種酶類和代謝產(chǎn)物,用于預(yù)測,診斷以及治療監(jiān)測,協(xié)助臨床醫(yī)生診治疾病提供數(shù)據(jù)參考。臨床生化檢驗基礎(chǔ)知識培訓(xùn)一、生化基礎(chǔ)知識二、生化儀器基礎(chǔ)知識三、部分生化項目的臨床意義本文檔僅供生化應(yīng)用工程師參考閱覽,更多專業(yè)知識請查閱后附參考文獻(xiàn)。 肖自強 2014319一、 生化基礎(chǔ)知識(Reagent),最終以水溶液的方式與待測物發(fā)生一系列化學(xué)或者生化反應(yīng),通過生成物或反應(yīng)物中某物質(zhì)的吸光度變化,測量待檢測物中某種特定物質(zhì)的含量。:肝功、血脂、腎功、心肌、代謝、免疫amp。其他。K 為吸收系數(shù),是與入射輻射的波長及吸收物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù) 。c 為吸收物質(zhì)的濃度。cm,稱為摩爾吸收系數(shù),通常用ε 表示。ε愈大,表示物質(zhì)對某波長輻射的吸收力愈強,因而分光光度法測定的靈敏度就愈高.:實測值偏離了朗伯比爾定律。2 雜散光的影響:雜散光(stray light) 是進(jìn)入檢測器待測波長以外的光。3狹縫寬度的影響:單色器設(shè)有進(jìn)、出口狹縫,狹縫愈窄,單色光愈純,吸光度增加,但輻射能減小,對弱吸收帶的測量有一定影響。當(dāng)出、入射狹縫寬度相等時,狹縫寬度引起的誤差最小。其結(jié)果使光通過吸收物質(zhì)的光程不固定,散射光的一部分和透射光一起進(jìn)入檢測器,導(dǎo)致偏離 Beer 定律。2. 熒光效應(yīng):分子吸收輻射能后產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)分子以重新發(fā)射輻射的方式回到基態(tài)而發(fā)射熒光。一般情況下,熒光效應(yīng)對分光光度法產(chǎn)生的影響較小。5測定過程中產(chǎn)生的誤差:化學(xué)反應(yīng)引起的誤差, 人為的誤差等,在此不作詳細(xì)解釋。:1雙波長:由主波長和副波長構(gòu)成的兩個波長,測定樣品采用雙波長可以消除對實驗的影響。副波長是指測定某物質(zhì)時,為消除其他干擾物質(zhì)在主波長造成測定干擾所設(shè)定的波長。3試劑空白 :在各特定波長下,光通過以蒸餾水或生理鹽水為樣品和相應(yīng)測定項目試劑構(gòu)成的反應(yīng)體系所測得的吸光度值?;蛴缮飿悠泛拖鄳?yīng)測定項目試劑構(gòu)成的反應(yīng)體系產(chǎn)生反應(yīng)最初時間所測得的吸光度值。因為該法常有標(biāo)準(zhǔn)液,因此又稱比例終點法,是經(jīng)過一定反應(yīng)時間后,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡(終點)時做到的一點分析法。其中又分一點終點和兩點終點法。在酶促反應(yīng)過程中,不是任何時期的反應(yīng)速率都和酶濃度成正比。當(dāng)復(fù)合物(ES)分解,生成產(chǎn)物(P) ,酶促反應(yīng)速度急驟上升,經(jīng)過很短的作用時間后,產(chǎn)物的生成量或底物的減少量與反應(yīng)時間成線性關(guān)系,反應(yīng)速度保持恒定不變,這一時期稱為零級反應(yīng)期。此時的反應(yīng)速率常常不能準(zhǔn)確反應(yīng)酶的含量。 7兩點速率法:兩點速率法也叫固定時間法,對測定及標(biāo)準(zhǔn)采用兩個時間點測定。但真性肌酐與苦味酸的反應(yīng)為快反應(yīng),假肌酐為慢反應(yīng),因此測試時測試時間一般在樣品與堿性苦味酸試劑混合后 25 秒和 1 分 25 秒在 500nm 處測吸光度變化。8普通免疫比濁與膠乳增強免疫比濁法:普通免疫比濁法是抗原與相應(yīng)的抗體直接結(jié)合形成的免疫復(fù)合物,在反應(yīng)液中具有一定的濁度,可由一般分光光度法進(jìn)行透射比濁(transmission turbidimetry)測定,可用于某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測定。膠乳增強免疫比濁法是將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上,制成致敏的膠乳顆粒,當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時,發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),形成抗原抗體復(fù)合物,膠乳顆粒發(fā)生凝集。 該法比普通免疫比濁敏感度高,試劑穩(wěn)定,個體免疫復(fù)合物對結(jié)果影響也小,因此結(jié)果穩(wěn)定、可靠,特異性好,精確度高。10檢測限: 是指檢測系統(tǒng)可檢測出的最低分析物濃度。靈敏度與線性范圍:靈敏度與線性范圍有著緊密聯(lián)系,這也是跟生化儀的性能有關(guān)。一般儀器能測的光 密度值最大在35000。相反,如果 1個單位濃度變化能引起儀器吸光度響應(yīng)量為100,那么它能測的濃度范圍為0~350,這個線性范圍是可以的。 :終點法或兩點速率法,必須通過使用標(biāo)準(zhǔn)液,建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線;速率法,采用標(biāo)準(zhǔn)液校正可消除系統(tǒng)誤差,也可直接輸入Factor值。 參考區(qū)間大多是采用正態(tài)分布的原理制定,以95%的分布區(qū)間(x177。不論采用什么方法,總有少數(shù)正常人的測定值落在異常范圍內(nèi)。當(dāng)結(jié)果接近上限或下限時,不要輕易下正?;蛴胁〉慕Y(jié)論,要根據(jù)被測者的其他表征綜合判斷或過一段時間復(fù)查后,再做分析。是指臨床上必須采取措施時的檢測水平。醫(yī)學(xué)決定水平可在疾病診斷中起著排除或確認(rèn)的作用,對某些疾病進(jìn)行分級或分類,或愈后做出估計,來提醒醫(yī)生在臨床上做出相應(yīng)的處理方式。它的應(yīng)用可以克服只使用參考范圍的缺點,使一個檢驗結(jié)果對病人能起到提供診斷,處理依據(jù)的作用。體內(nèi)幾乎所有的代謝反應(yīng)都是在不同的酶催化下進(jìn)行的。用酶作試劑(工具酶)測定非酶物質(zhì)具有效率高、特異及易于實現(xiàn)自動分析的特點,是目前臨床生化檢驗的主流方法。在研究某一因素對酶促反應(yīng)速度的影響時,反應(yīng)系統(tǒng)中其他因素不變。在建立定量測定酶活性的方法時,需要研究酶促反應(yīng)的速度及影響此速度的因素,通常稱之為反應(yīng)動力學(xué)。要保證只有待測酶的量影響反應(yīng)速率,其他各種影響反應(yīng)速率的因素都在嚴(yán)格控制之下,并保持各測定間的一
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