【正文】 A 免疫后需經(jīng)過特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)才能激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答有關(guān)。為特異性強(qiáng)、純度高的單克隆抗體的制備提供了一個(gè)省時(shí)省力的好方法。DNA 肌肉注射后，被肌細(xì)胞攝取的 DNA半衰期延長，蛋白質(zhì)持續(xù)表達(dá)，并且加強(qiáng)了 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞的記憶持久性。還有人發(fā)現(xiàn)肌肉注射 DNA 的特異性蛋白質(zhì)表達(dá)效率明顯高于靜脈注射 DNA，經(jīng)皮內(nèi)注射和肌肉注射等量 DNA，發(fā)現(xiàn)肌肉免疫的方法產(chǎn)生特異性抗體和 CTL 的效率高，因而肌肉注射方法最佳。但有人把 DNA 直接注射至小鼠的股四頭肌也能很好地激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。 具體方法一般選用 5 一 8 周齡的 BALB/C 雌性小鼠，免疫 6 周齡以下小鼠可獲得更好的免疫應(yīng)答，免疫 4 周齡小鼠特異性蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高。雖然 DNA 免疫后在體內(nèi)如何被細(xì)胞攝取及其表達(dá)的抗原又如何被遞呈尚未完全清楚，但許多文獻(xiàn)均證實(shí)了肌細(xì)胞對(duì) DNA 的攝取及抗原蛋白的表達(dá)起到很重要的作用。在抗原的免疫原性無法改變的情況下，可提高機(jī)體對(duì)相應(yīng)抗原的反應(yīng)性。 技術(shù)原理 現(xiàn)代免疫學(xué)研究表明，機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答取決于兩個(gè)要素:①抗原的免疫原性。4 DNA 免疫制備抗體技術(shù)DNA 免疫是近年發(fā)展起來的一種新型抗體制備法。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)核糖體展示技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是一方面能產(chǎn)生更大的抗體庫,庫容可達(dá)到1015 ,另一方面可以方便地與一些特殊的 PCR 技術(shù) ,如性別 PCR、錯(cuò)配 PCR 等結(jié)合,獲得更多的抗體遺傳多樣性,而且所表達(dá)的抗體具有正確的空間折疊構(gòu)象。 技術(shù)原理該技術(shù)建立不受細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)等因素影響的完全體外展示系統(tǒng)，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增含目的基因的 cDNA 文庫，同時(shí)引入啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯耦聯(lián)系統(tǒng)作用下，形成“蛋白質(zhì)核糖體mRNA”三元復(fù)合物，構(gòu)成核糖體展示的抗體庫，再用相應(yīng)的抗原對(duì)翻譯混合物進(jìn)行篩選并從中分離 mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)富集目的基因，并將目的基因?qū)氡磉_(dá)載體，從而獲得庫容量大、特異性強(qiáng)、親和力高的人源基因工程抗體庫。 在淘選過程中會(huì)出現(xiàn)高 親和力低拷貝的特異性噬菌體抗體的丟失等。 技術(shù)缺點(diǎn)但是該技術(shù)也存在一定的缺陷,由于受表達(dá)系統(tǒng)的限制,抗體庫的庫容不足以支持獲得稀有的抗體,難以涵蓋一些動(dòng)物抗體的多樣性。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)噬菌體展示技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是一旦噬菌體庫建立后,就可以根據(jù)需要直接從文庫中篩選得到針對(duì)目標(biāo)抗原的特異性抗體,大大縮短了單克隆抗體的制備周期并且得到的抗體可用于制備完全人源化抗體。用表達(dá)有相應(yīng)抗體分子的噬菌體顆粒去感染宿主菌,使該噬菌體顆粒得到擴(kuò)增。 技術(shù)原理它是一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，建立在噬菌體外殼具有表達(dá)抗體蛋白片段能力的基礎(chǔ)上，以改構(gòu)的噬菌體為載體，用基因工程技術(shù)克隆人抗體可變區(qū)的全套基因,然后將克隆的基因插入噬菌體編碼衣殼蛋白的基因中,這樣在噬菌體表面表達(dá)特定抗體片段,而在噬菌體核心 DNA 中則含有該抗體片段的基因，建立了噬菌體抗體文庫，形成獲得一個(gè)具有上億個(gè)體外方式制得的不同抗體的基因數(shù)據(jù)庫。在維持抗體活性和減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸殘基替換，使抗體與抗原結(jié)合具有更好的親和力和特異性。目前重構(gòu)抗體是對(duì)鼠源性單抗人源化改造最常用、最基本的方法。SDR 移植抗體僅將異源抗體 CDR 區(qū)內(nèi)與抗原結(jié)合關(guān)系密切的 SDR，移植到人抗體相應(yīng)位置上，使人源化抗體的免疫原性進(jìn)一步降低。1．2 人源化抗體制備技術(shù) 人源化改造主要是重構(gòu)抗體和表面重塑抗體。然而，盡管盡力降低鼠源成分，這實(shí)現(xiàn)了抗體的高度人源化,但仍可誘發(fā)排異反應(yīng),并未完全解決鼠抗體的免疫原性問題,而且人源化過程繁復(fù)且費(fèi)用昂貴,大量的反復(fù)試驗(yàn)不可避免。1980 年代中后期,科學(xué)家對(duì)嵌合抗體進(jìn)一步改進(jìn)后,抗體基因只有互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)是鼠源成分,其余均為人基因序列, 技術(shù)原理即將鼠源性單抗在保留其抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，盡可能去除鼠源化部分或代之以人源化片段，從而盡可能減少單抗的異源性，然后根據(jù)所用的載體質(zhì)粒標(biāo)記基因產(chǎn)物,選用適當(dāng)?shù)目股鼗蛟噭┻M(jìn)行篩選,再用與傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗體的細(xì)胞株。到 2022 年，全球單克隆抗體藥銷售額有望達(dá) 980億美元左右?？贵w市場是從 2022 年之后開始蓬勃興起的，20222022 年間單抗藥物復(fù)合增長率達(dá)到 41%。此外，前景廣闊的單抗藥物受到藥企的青睞，很多跨國藥企通過收購技術(shù)平臺(tái)涉足這一領(lǐng)域，羅氏是這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)典型的例子，其收購的基因泰克公司是單抗藥物行業(yè)的全球領(lǐng)跑者?！蹲匀弧冯s志預(yù)測，2022 年全球銷售額前 10 名的藥物中有 6 個(gè)為抗體藥物并占據(jù)銷售額最大的前 3 位。此外,傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)還存在制備周期較長,成本較高,雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定抗性會(huì)丟失等缺陷。 另一方面，鼠 McAb 還具有免疫原性，產(chǎn)生人抗鼠抗體，既降低單抗的治療效果，又誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)。1975 年,Kohler 和 Milstein 創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體( monoclonal antibody，McAb) ，所謂 McAb 是利用 HAT 培養(yǎng)基篩選出既能穩(wěn)定生長又能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是由識(shí)別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的具有高度特異性和均一性的抗體，故稱之為 McAb。其試劑可用于臨床診斷和治療,或用于以單抗為彈頭的“生物導(dǎo)彈”藥物等。專業(yè)課程論文題 目: 單克隆抗體綜述及其行業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)分析 姓 名: 徐夢佳 學(xué) 院: 食品科技學(xué)院 專 業(yè): 生物工程 班 級(jí): 102 班 學(xué) 號(hào): 18410221 指 導(dǎo)教師: 王曉晴 2022 年 3 月 20 日單克隆抗體綜述及其行業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)分析摘要：單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，它可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系。生產(chǎn)出針對(duì)復(fù)雜生物混合物中的特定分子的抗體,可用于分離、分析及純化該特定分子抗原。近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了嵌合抗體制備技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)等，這些技術(shù)有效地解決了單克隆抗體鼠源性等問題，還有 DNA 免疫制備抗體的研究進(jìn)展，使單克隆抗體憑借自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)在治療腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景，故單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展也就顯得尤為重要。單克隆抗體技術(shù)自問世以來,在臨床治療方面進(jìn)展緩慢,，主要原因是目前單克隆抗體大多是鼠源性的,而鼠源單抗應(yīng)用于人體治療時(shí)存在諸多問題:一方面，鼠源單抗與自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面 Fc 段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用較弱，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱，人血循環(huán)中的半衰期短，它發(fā)揮細(xì)胞毒作用作用的時(shí)間較短。因此,在保持對(duì)特異抗原表位的高親和力的基礎(chǔ)上人源化和全人化的改造,減少異源抗體的免疫原性成為單抗研究的重點(diǎn)。要解決傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)所存在的問題,為單克隆抗體的應(yīng)用提供更廣闊的空間，出現(xiàn)了嵌合抗體制備技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、DNA 免疫制備抗體技術(shù)，制備單克隆抗體。全球范圍內(nèi)單抗藥產(chǎn)業(yè)的布局是不平衡的，其中歐美研發(fā)實(shí)力最強(qiáng)，產(chǎn)品線豐富，而屬于新生力量的中國正大力發(fā)展單抗藥物，努力提供單抗藥物產(chǎn)品線。 全球生物制藥產(chǎn)業(yè)正處于快速上升期，其中單克隆抗體藥物最為活躍，相比 2022 年的 480 億美元，2022 年全球單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到 628 億美元，增速為 %。中國行業(yè)研究網(wǎng)發(fā)布的《20222022 年中國單克隆抗體行業(yè)投資分析及深度研究咨詢報(bào)告》顯示：未來，全球單克隆抗體藥依舊會(huì)保持較高的增長率。一．單克隆抗體綜述 1．1 人鼠嵌合抗體制備技術(shù) 該技術(shù)產(chǎn)生于 1980 年代中期,是應(yīng)用 DNA 重組技術(shù)將人 McAb 的恒定區(qū)基因替換鼠 McAb 的恒定區(qū)基因，從而編碼產(chǎn)生的 McAb。 技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)嵌合抗體不但具有與鼠源單抗相同的特異性、親和力和產(chǎn)量,而且可根據(jù)不同的需要接上不同亞類的人恒定區(qū)基因來改變抗體的功能,使用更加靈活。因此又發(fā)展出了產(chǎn)生全人單克隆抗體的技術(shù)。 技術(shù)原理抗體上，并不是整個(gè) CDR 都參與抗原的特異性識(shí)別，在 CDR 區(qū)中僅一部分氨基酸殘基與抗原結(jié)合，這些氨基酸殘基決定抗體的特異性，被稱之 SDR。 缺點(diǎn)及改進(jìn)方法SDR 移植抗體往往存在親和力和特異性降低的缺點(diǎn)。表面重塑抗體是對(duì)鼠抗體框架區(qū)表面氨基酸的殘基進(jìn)行重塑或替換，該技術(shù)僅改造或替換與人抗體有明顯差異的表面氨基酸的殘基。2．噬菌體抗體庫技術(shù) 噬菌體抗體庫技術(shù)是迄今發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的抗體庫技術(shù)。 制備方法抗體的具體制備方法是將抗原包被在固定介質(zhì)上,加入待篩選的噬菌體顆粒與固定的抗原結(jié)合,獲取結(jié)合的抗體,將未結(jié)合的抗體洗脫,從噬菌體庫中篩選出針對(duì)特定抗原的特異性抗體的可變區(qū)。將抗體可變區(qū)與恒定區(qū)組合得到具有完整能的全人單克隆抗體。當(dāng)抗體分離出來時(shí),噬菌體系統(tǒng)同時(shí)也提供了設(shè)計(jì)抗體親和性及其應(yīng)用的模式。 而且對(duì)噬菌體或表達(dá)宿主的生長或功能產(chǎn)生抑制作用的抗體也難以獲得，非免疫抗體庫獲得的抗體親和力不高。3． 核糖體展示技術(shù) 核糖體展示技術(shù)是一種完全在體外合成并篩選蛋白質(zhì)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)。核糖體展示系統(tǒng)的抗體篩選過程與噬菌體展示系統(tǒng)的過程相類似。核糖體展示技術(shù)已經(jīng)成功地用于生產(chǎn)抗黃體酮的抗體片段。DNA 免疫克服了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)免疫方法的缺陷，能更為有效地激發(fā)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為某些疾病如病毒性疾病和腫瘤等的診斷和免疫治療開拓了新的途徑。②機(jī)體對(duì)抗原的遞呈及相應(yīng)的反應(yīng)性。目前 DNA 免疫的焦點(diǎn)是抗原的遞呈機(jī)制及佐劑對(duì) DNA 免疫的影響。由皮膚和肌肉途徑給予 DNA 均可產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Webster 等認(rèn)為在DNA 免疫中最有效的方法和途徑是用基因槍在肌肉或皮內(nèi)免疫 DNA 包被的金顆粒。通過這兩種免疫方法制備的單克隆抗體均能被 DNA 編碼的蛋白識(shí)別。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)DNA 免疫較常規(guī)免疫產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答強(qiáng)而持久，因此用 DNA 免疫制備單克隆抗體和多克隆抗體可以省時(shí)省力。DNA免疫可用于已知 DNA 編碼而又不能得到目的蛋白或獲得的抗原蛋白為低免疫原性抗原的免疫，也可用于大動(dòng)物免疫如兔、豬等。 技術(shù)存在缺點(diǎn)大部分 DNA 被核酸酶降解，解決 DNA 在動(dòng)物體內(nèi)的穩(wěn)定性是 DNA 免疫的關(guān)鍵。③DNA 免疫是否還誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫耐受還有待于深入的探討。DNA 免疫不僅在無法獲得純化蛋白質(zhì)的情況下開拓了研制特異性抗體的新途徑，而且逾越了抗原的低免疫原性的障礙，有效地激發(fā)宿主的特異性免疫應(yīng)答。二．中國單克隆抗體藥物市場應(yīng)用狀況態(tài)勢分析、腫瘤上的研究和發(fā)展中國癌癥、腫瘤發(fā)病及死亡率概況分泌營養(yǎng)和代謝疾病、消化系病、泌尿生殖系病、神經(jīng)系病、精神障礙，前十位死因合計(jì)占死亡總數(shù)的 ％。目前中國每年新發(fā)病例為 220 萬，因癌癥死亡人數(shù)為 160 萬，現(xiàn)有病例 310萬。中國每 4~5 個(gè)死亡者就有 1 個(gè)死于癌癥。但是，在癌癥患者逐年上升的情況下，卻有一半患者得不到規(guī)范治療。份額增長較快的類別有小分子激酶抑制劑（特別是 2022 年，份額擴(kuò)大了 倍；單抗類也有將近 100%的增長；雖然這兩類絕對(duì)份額還不高，但發(fā)展迅速；鉑類抗癌藥由于有奧沙利鉑的加入，5 年來的份額也是逐漸擴(kuò)大；而抗代謝類抗癌藥近兩年由于他濱類藥物的上市和普及，市場份額也有提高；抗生素類抗癌藥和細(xì)胞毒類藥物由于無新產(chǎn)品上市，份額逐漸被其他新藥所搶占。國外制藥巨頭也看好國內(nèi)抗腫瘤藥市場潛力，引入新產(chǎn)品的速度明顯加快，一些產(chǎn)品在國外剛上市一年，在國內(nèi)已有進(jìn)口產(chǎn)品。而且這些藥物價(jià)格昂貴，目前國內(nèi)的消費(fèi)水平還不足以使這些藥物大面積鋪開。圖表 1 國內(nèi)抗腫瘤藥亞類份額變化%%%%%%%中 藥 類 抗 癌 藥植 物 類 抗 腫 瘤 藥小 分 子 激 酶 抑 制 劑細(xì) 胞 毒 類 抗 腫 瘤 藥其 他內(nèi) 分 泌 類 抗 腫 瘤 藥抗 生 素 類 抗 腫 瘤 藥抗 代 謝 類 抗 腫 瘤 藥基 因 工 程 藥 物單 抗鉑 類 抗 腫 瘤 藥中 藥 類 抗 癌 藥 % % % % %植 物 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %小 分 子 激 酶 抑 制 劑 % % % % %細(xì) 胞 毒 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %其 他 % % % % %內(nèi) 分 泌 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %抗 生 素 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %抗 代 謝 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %基 因 工 程 藥 物 % % % % %單 抗 % % % % %鉑 類 抗 腫 瘤 藥 % % % % %2022年 2022年 2022年 2022年 2022年圖表 2 國內(nèi)抗腫瘤亞類增長情況0100000000202200000300000000400000000500000000600000000700000