單克隆抗體與基因工程抗體的制備-展示頁
2025-01-26 08:17本頁面
【正文】 細(xì)胞通過替代途徑合成 DNA HAT選擇作用： 淋巴細(xì)胞： 不能生長， 5~7天死亡； DNA合成的主要途徑被 A阻斷 骨髓瘤細(xì)胞： 不能生長， 5~7天死亡； HGPRT缺乏， DNA合成的替代途徑受阻 SP2/O: HGPRT ， TK。 飼養(yǎng)細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞 (1:3) 50% PEG 1min內(nèi)加完 。 漿細(xì)胞 。 淋巴細(xì)胞 。第四章 單克隆抗體與基因工程抗體的制備 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 一、雜交瘤技術(shù) 二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存 第二節(jié) 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性 第三節(jié) 基因工程抗體制備 一、人源化抗體 二、小分子抗體 三、抗體融合蛋白 四、雙特異性抗體 五、噬菌體抗體庫技術(shù) 第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用 一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 二、蛋白質(zhì)的提純 三、小分子抗體的應(yīng)用 四、抗體融合蛋白的應(yīng)用 五、雙特異抗體的應(yīng)用 六、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景 思考題 小結(jié) 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 雜交瘤技術(shù)原理： 聚乙二醇（ PEG）： 細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì) 胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合 HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)： 反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤 細(xì)胞系 單克隆抗體生成： 接種雜交瘤 細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體 抗體種類： 第一代抗體 多克隆抗體 （ polyclonal antibody) 第二代抗體 單克隆抗體（ monoclonal antibody) 第三代抗體 基因工程抗體（ geic engineering antibody) B淋巴細(xì)胞 :壽命短 ,分泌特異系性抗體 骨髓瘤細(xì)胞： 壽命長 雜交瘤細(xì)胞： 壽命長，單克隆抗體 流 程 一、雜交瘤技術(shù) 不產(chǎn)生 Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT。TK 與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同 （一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞 動(dòng) 物： BALB/c小鼠 7～ 12周齡 20g～ 25g體重 （二）免疫脾細(xì)胞 細(xì)胞性抗原： （ 1~2） 107/只，不加佐劑， 2~3周重復(fù)一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑 +100微克抗原， 3~6周100~200微克抗原，融合前 3天，加強(qiáng)免疫 免疫小鼠 。 淋巴細(xì)胞發(fā)育 。 抗原接種 培養(yǎng)液： RPM1640培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)液 （三）細(xì)胞融合 細(xì)胞融合劑： PEG:分子量 4000 的 PEG是最常用的細(xì)胞融合劑 作用機(jī)理： 誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合 作用特點(diǎn)： 隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同 培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞： 選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng) 細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊 避免細(xì)胞返祖：定期用 8AG處理細(xì)胞 注意事項(xiàng)：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于 80℃ 或液氮及干冰中 免疫脾細(xì)胞的制備： 1 108的 淋巴細(xì)胞 無菌手術(shù) 飼養(yǎng)細(xì)胞： 細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖 常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞 其中 MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用 飼養(yǎng)存活一般不超過 2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化 。 2min內(nèi)加 10ml培養(yǎng)液 融合方法 SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為 1： 2～ 5 1ml 50%的 PEG（無菌，預(yù)溫 37℃ ）在 1分鐘內(nèi)滴完 ,靜置 90秒 ,時(shí)間一到 ,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入 ,停止 PEG作用 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入 HAT培養(yǎng)基，使之分加到 96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（ ～ ） 105個(gè)。 長 命 脾細(xì)胞 : HGPRT+ ， TK+ 。 長命 骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與 雜交瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞： 長期生長繁殖 利用淋巴細(xì)胞的 HGPRT，將 H合成為嘌呤堿并最終與 T一起合成 DNA 從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力 有限稀釋法 (limiting dilution)
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