【正文】 號放大 1(100)倍。 光電二極管用于探測 FSC，因為 FSC是強信號。 探測器 ： 在流式細胞儀中有二種探測器：光電二極管和光電倍增管 (PMTs)。顆粒通過激光束時產 生光 信號，然后轉換成電信號，并在點圖上相對應于一個道值。調補償用對照包括單陽性熒光試劑和同型對照試劑，如：調 FITC補償對照包括下列試劑： CD3－ FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。 同型對照包括下列試劑：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。在 CellQuest軟件中， 儀器的控制菜 單位于 Cytometer 菜單中。在優(yōu)化之前需運行 FACSComp.。一個實驗文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來分析，分析圖不能用來獲取。 ? 實驗文件可轉化為文具薄。 ? 實驗文件可以通用模板儲存以用于常規(guī)獲取和分析。若實驗文件的目錄改變，二者的聯系不會改變，實驗文件仍可找到其數據文件。若數據文件未改變目錄或被刪除，實驗文件可找到其數據文件。 CellQuest實驗文件的菜單由File菜單下 New、 open、 close、 save及 save as等 (同 Microsoft Word)。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 3 CellQuest實驗文件 ：您設置的圖、 region、 gate、統計 (statistics)、 markers、文字、顏色 等都將保存。該文件含有從流式細胞儀獲取的平均 202010000個顆粒數的數據。 CellQuest 的文件： FCS list mode數據文件 ：是流式細胞儀的標準格式數據文件（ ）。 16. 文本：點擊，然后點擊定位插入點并編輯文字。 13. 直方圖 region：點擊 ，可在直方圖上定位 region 的左邊界和右邊界 14. 橢圓形 region: 點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需大小。 11. 矩形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需 大小。 9. 縮?。狐c擊，然后點擊圖，將放大圖縮小到原大小。 7. 直 方圖 marker：點擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。 5. 密度圖：點擊，可畫密度圖，可自定義圖的大小。 3. 3 維圖：點擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。 工具板按鈕 (見圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。 工具板 工具欄可用來畫圖、 region, marker和文字等。 從獲取到分析 在 CellQuest中，從獲取到分析的功能允許在數據獲取結束后可從獲取圖轉換到分析圖。在分析時，將讀取數據文件，然后可畫 Region(區(qū) )、 設置 marker (標尺 )和進行統計。在獲取前，需用您的樣本來優(yōu)化儀器的條件。也可通過 CellQuest調節(jié)儀器條件，設定獲取最佳條件并 可將其儲存。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 1 第五章 CellQuest 軟件 學習本章后應能夠： ? 用 CellQuest 從流式細胞儀獲取 3色或 4色樣本 ? 用 CellQuest 從流式細胞儀分析 3色或 4色樣本 ? 將統計結果輸出為電子表格 ? 應用 Region（區(qū)）和 Gate（門）生成統計 ? 獲取和分析 3色免洗絕對記數樣本 概述 CellQuest是從流式細胞儀上進行獲取和分析數據的通用軟件。 CellQuest軟件功能強大且靈活，并與 Macintosh 的多任務環(huán)境完全兼容。 獲取 即收集并儲存流式細胞儀上數據的過程。 分析 將獲取的數據進行進一步分析。在 CellQuest中，可畫單參數直方圖、雙參數點圖、密度圖和等高圖。剛剛獲取的數據及在獲取時限定的格式出現在圖中 ，如 region, marker,color 等。點擊選擇。 2. 選擇：點擊，可選擇一個或多個目標，進行改大小或移動。 4. 直方圖：點擊，可畫直方圖，可自定義圖的大小。 6. 點圖：點擊，可畫點圖，可自定義圖的大小。 8. 象限 marker：點擊，可在點圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 10. 放大：點擊，然后點擊圖，將縮小圖放大到原大小。 12. 多邊形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊形成起始點，然后拖動鼠標 畫出多邊形頂點并在起始點處點擊完成多邊形 region 。 15. 箭頭：點擊，然后在實驗文件中點擊，拖出直線。 17. 計算器：如果自動復計算關閉，點擊進行數據復計算。當Aqusition Control 窗口的 Setup前未打 ? 時，進行獲取后自動保存的文件格 式。一個含有 4參數 10000細胞數的數據文件若 256道分辨率則文件大小為 45kb，若 1024道分辨率則文件大小為 85kb。數據文件不在實驗文件中保存。 注意：實驗文件和它的數據文件之間存在一定限制。若二者聯系喪失，需將丟失的數據文件放在其實驗文件同一目錄，實驗文件才能找到其數據文件。 ? 實驗文件可以后打開以恢復獲取和分析。除數據文件外所有條件（包括region、 gate、 statistics）都可以通用模板儲存。 ? 在實驗文件中，有 3種圖：獲取、分析和獲 取到分析。 CellQuest 的儀器控制： 在數據收集之前，需用樣本優(yōu)化儀器條件。需為每一組樣本選擇適當的對照，如：判斷非特異性結合的同型對照。 在用 CellQuest進行 3色或 4色分析中，應用同型對照和調補償用對照進行儀器條件設 置。 它將用 于調節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設淋巴細胞 region、確認FL1/FL2/FL3/FL4的設置及象限設置。 調節(jié)探測器和放大器可使所需信號出現在數據圖的適當位置。依據所選的分辨率的不同，道 值有從 0－ 25 0－ 1023不同范圍。 光電二 極管對光 的敏感度低于光電倍增管?？赏ㄟ^電壓而選擇對 FSC 信號 的不同放 大。 E01：將信號放大 10(101)倍。 E03: 將信號放大 1000(103)倍。 光電倍增管 (PMTs)用于探測 SSC、 FL FL FL3, 因為它們是弱信號。當電壓上升時，信號增加，數據出現在道值較高處。 (見圖 2) 放大器 ： 可對信號進行微調。 若 放大模式選擇 Lin(線性 )，放大器的增益 可在 1－ 。若放大模式選擇 Log(對數 )，放大器的增益則不可調節(jié)。 閾 值 ： 可用來設置低于該道值的數據信號不被處理，只有高于或等于閾值道數的信號才傳送到計算機進行處理。 在免疫表型中， 在 FSC上設閾值。可通過點擊 ??來選擇或直接拖動 滑標上下移動 (見圖 3)。 補 償： 當樣本用 2色或 3色熒光染色時需調節(jié)補償以消除光譜重疊。 FITC主要出現在 FL1探測器上，但也有 部分重疊到 FL2探測器上。 補償調節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補償調節(jié)量依賴于探測器的電壓。 補償調節(jié)可通過點擊 ??來選擇或 直接拖動滑標上下移動。在菜單位于 Cytometer菜單中 (見圖 5)。 狀態(tài)： 顯示儀器運行模式 Not Ready: 激光器正在預熱、鞘液桶空、廢液桶滿 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 6 Ready: 樣本管插在 SIP上且支撐臂位于中位 (即管下 )，樣本管加壓，儀器在 RUN 狀態(tài) Standby: 儀器在 Standby 狀態(tài)或儀器在 Run 狀態(tài)而無樣本管在 SIP上或支撐臂位 于側位 (即不在管下 )或樣本管未完全 加壓。 激光器電源： 以 mW表示，在 RUN時，為 15mW；在 Standby 時，為 3－ 6 mW 。當插上樣本管于 SIP時，樣本壓 力和鞘液壓 力之間的差異增加，該樣本電壓降低。 廢液 ： 顯示廢液桶是滿或 OK。它們在顯示上有三種形式 (見圖 6)： 激活 ： 外框呈灰色。每次只能激活一個圖。 被選擇 ： 在每個角出現黑色方塊。一次可選擇多個圖?？赏ㄟ^下列 2種方式選擇多個圖：撳 Shift鍵同時點擊多個圖框或在實驗文件中點擊任何對角線拖框包繞欲選的圖。 只要被選圖才可以更改大小、刪除和移動。點擊圖外的任何地方即可去 選擇。 BD FACSCalibur 中文培訓手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 7 練習： 3 色或 4色數據獲取 在此練習中，您將： ? 用 FACSComp軟件進行儀器質控。247。 ? 在獲取中，設定數據收集和儲存。 CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC。 ? 建立模板 ? 輸出統計結果 質 控－運行