【正文】 白質(zhì)晶體已有很多 ， 但直到 1934 年 ， 英國著名晶體學(xué)家伯納爾 （ J. Bernal） 和克蘿芙特 （ D. Crowfoot, 就是 1956年解出維生素 B12晶體結(jié)構(gòu)的 霍奇金 教授 ， 她因此而獲得 1964 年諾貝爾獎 ） 才發(fā)現(xiàn) ， 研究蛋白質(zhì)晶體應(yīng)該和小分子晶體完全不同 ， 后者往往是暴露在空氣中；而前者必須與母液一起密封在毛細管內(nèi) ， 以免蛋白質(zhì)晶體暴露在空氣中因失水而破壞 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 圖 56 晶體中晶胞和不對稱單位的關(guān)系 。 顯然 ， 只有晶胞才是晶體的最小單位 。 因為晶胞有對稱性 ， 所以晶胞內(nèi)部由對稱元素相關(guān)的最小單位又稱為 不對稱單位 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體的另一個重要 性質(zhì) 就是 對稱性 。 于是， 晶胞的選取只有 7種類型 ， 稱為 7種晶系 。 通常 ， 一個中等大小的單晶體 ， 邊長 2~3mm 的立方體內(nèi)含有 1020個左右這樣的平行六面體 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體的最小結(jié)構(gòu)單位叫晶胞 ， 晶體就是通過晶胞在三維空間的周期重復(fù) （ 平移 ） 而構(gòu)成的 。 晶體的最基本特征是它的內(nèi)部高度有序性 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 晶體 晶體是衍射光柵 ， 是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的研究對象。 富里哀理論 表明， 任何一個有理的周期函數(shù)都可以通過把足夠數(shù)量的正 （ 余 ） 弦函數(shù)相疊加起來構(gòu)成原來的那個周期函數(shù)。 所以 ， 還要介紹富里哀綜合法在測定晶體結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用 。 它將入射線波長 、 衍射線方向以及光柵結(jié)構(gòu)三者建立起了數(shù)學(xué)的定量關(guān)系 ， 為 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ) 。 晶體中分子內(nèi)原子間距在 nm 范圍左右 ， 所以使用波長 nm 左右的 X 射線可以使晶體產(chǎn)生衍射現(xiàn)象 ， 這是因為核外電子散射 X 射線的結(jié)果 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 條件是光柵的尺寸要和射線的波長是同數(shù)量級的 ， 這樣光柵上不同結(jié)點上的散射線才能發(fā)生相干 ， 即疊加。 當不考慮衍射線強度時 ， X 射線衍射與可見光的衍射很相似 ， 簡單說來 ， 都是光線通過光柵后改變了光線的傳播方向的一種物理現(xiàn)象 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ☆ 2 . X 射線衍射 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析所依賴的物理原理是 X 射線的衍射現(xiàn)象 ， 衍射現(xiàn)象的產(chǎn)生是 X 射線與組成晶體的原子核外電子相互作用的結(jié)果 。 它是使用同步加速器的高能物理研究實驗室所提供的寄生輻射 ， 其波長在 nm~1 ?m 之間 （ 從紫外線到 X 射線 ） ， 見圖 520。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 生成 X 射線的另一種方式是同步加速器輻射 。 這種 X 射線的波長嚴格和構(gòu)成該材料的原子能級相匹配 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體結(jié)構(gòu)分析所使用的 X 射線波長大多在 nm 左右 ， 與分子中原子的距離相當 。 ☆ 1. X 射線 X 射線是德國物理學(xué)家 倫琴 在 1895 年發(fā)現(xiàn)的 。?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學(xué) ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學(xué) ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 一． 熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象 二． 熱力學(xué)函數(shù)與熱力學(xué)平衡 三． 熱容量 四． van’t Hoff焓 五． 折疊 /退折疊轉(zhuǎn)變 六． 量熱法與折疊過程熱力學(xué) 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)分析 ?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學(xué) ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學(xué) ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 一 、 折疊動理研究技術(shù) 二 、 兩態(tài)動理 三 、 過渡態(tài) 1. 折疊過程與過渡態(tài) 2. 對折疊過渡態(tài)的性質(zhì)分析 四 、 折疊中間態(tài) 1. 熔球態(tài) 2. 快態(tài)與慢態(tài) 3. 二硫鍵引起的中間態(tài) 4. 多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)分析 五 、 折疊的基本過程 1. 接觸形成 2. 螺旋 鏈環(huán)轉(zhuǎn)變 3. ?發(fā)卡形成 ?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學(xué) ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學(xué) ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 二 、 突變與熱穩(wěn)定性 1. 疏水突變 2. 氫鍵突變 3. 適應(yīng)極端條件的突變體 一 、 熱力學(xué)參數(shù)在分子水平上的解釋 1. 靜電相互作用 2. 范德華相互作用 3. 氫鍵 4. 疏水效應(yīng) 5. 二硫鍵 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)分析 三 、 突變與折疊過程 1. 過渡態(tài)的突變分析 2. 突變對穩(wěn)定性和折疊過程的影響 Nuclear Magic Resonance (NMR) Xray Crystallography CryoElectron Microscopy (cryoEM) 第十一講 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定 Nuclear Magic Resonance (NMR) Xray Crystallography CryoElectron Microscopy (cryoEM) Does not need crystals. More information about dynamics. Limit to MW 40,000. Less reliable. + + Atomic resolution. + Unlimited size. + Timeresolved study can be performed. + Techniques very robust. + Need crystals. Deal with very large plex. + Various sample forms can be studied. + Lower sample purity. + Does not need crystals. + Complicated experimental procedures. Lower resolution. 第十一講 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析是使用 X 射線作為物理工具 ， 以晶體作為研究對象 ， 晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法 。 所以 ， 從使用的物理工具和研究對象的觀點出發(fā) ， 它包含了 X 射線和晶體這兩方面內(nèi)容 。 隨后 ，人們發(fā)現(xiàn)了 X 射線的波動本質(zhì) ， 其波長范圍大約在~10 nm 的范圍 。 X 射線的生成主要有兩種完全不同的方式 ， 一種是陽極靶材料受到高能電子的轟擊 ， 原子的內(nèi)層電子躍遷到外層后又跳回內(nèi)層發(fā)出的所謂 特征 X 射線 。 比如銅的 K?輻射 ， 是銅的 K 殼層電子躍遷到 L 層又返回 K 層后所發(fā)出的輻射 ， 其波長約為 nm ， 這是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析經(jīng)常使用的 X 射線波長 。 當接近光速的高能帶電粒子在磁場中沿曲線軌道運行時 ， 沿切線方向就輻射出電磁波 ， 電磁波的波長和強度與電子能量相關(guān)聯(lián) 。 同步輻射因其輻射強度高 、 波長連續(xù)可變 、 準直性能好等特點而在許多科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)獲得了廣泛的應(yīng)用 ， 其中包括 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 。 X 射線衍射是勞厄 （ Laue ） 等人在 1912 年發(fā)現(xiàn)的 。 當光線打到光柵上時 ， 光柵上的每一個結(jié)點都變成了一個點光源 ， 它們向四面八方發(fā)射出與入射線有相同波長的散射線 ， 散射線在空間的疊加就會產(chǎn)生衍射現(xiàn)象 。 這是因為散射線的路徑方向不同會產(chǎn)生一個光程差， 從而造成散射線疊加 ， 其后果為 ， 在空間的某處光波加強 ， 在另一處則是減弱或相消 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 著名的布拉格公式 (2dhklsinθ=nλ)就是根據(jù)散射線疊加的原理推導(dǎo)出來的 。 當然 ， 光有布拉格公式還是不夠的 ， 因為它僅僅將光柵結(jié)構(gòu) （ 晶體中晶胞的大小和形狀 ， 包括它的對稱性） 和衍射方向聯(lián)系了起來 ， 至于晶胞中的原子種類及其在晶胞中的分布位臵還要靠衍射線的強度信息才能推導(dǎo)出來 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 周期函數(shù)和富里哀定理 周期函數(shù) 就是一個自身重復(fù)的函數(shù) 。 晶體中原子的核外電子在空間的分布是周期重復(fù)的， 被稱為 電子密度 。 要想使用 X 射線衍射來測定某物質(zhì)的結(jié)構(gòu) ， 就必須將該物質(zhì)先制備成晶體 。 也就是說 ， 組成晶體的分子 、 原子在三維空間中是嚴格按著一定次序周期排布的 ， 只有這樣才能形成衍射光柵 。 可以想象成晶體里面存在著無數(shù)個形狀 、 體積完全相同的小平行六面體 ， 這些平行六面體面靠面 ， 邊靠邊 ， 中間無縫隙 。 顯然 ， 僅根據(jù)物質(zhì)在晶體中周期排布這一性質(zhì)來選晶胞是不行的 （ 選取方式太多） ， 所以又增加了一些規(guī)則 ， 如晶胞的三邊盡量成直角等 。 此外 ， 通過深入的研究又發(fā)現(xiàn) ， 晶體中結(jié)構(gòu)通過平移產(chǎn)生的重復(fù)部分又被劃分成 14種不同類型的 點陣 ， 這都是幾何晶體學(xué)的內(nèi)容 。 晶胞存在的可能的 230 個空間群 ， 就是利用一定的對稱操作將某物質(zhì)的可重復(fù)部分在 14 種晶體點陣上的安排加以總結(jié)的結(jié)果 。 不對稱單位是晶體結(jié)構(gòu)分析的單位 ， 它雖然是分子結(jié)構(gòu)的 獨立 單位 ，但它不是晶體的 重復(fù) 單位 ， 因為它不說明晶體的 周期性質(zhì) 。 它們之間的關(guān)系可由圖 56 所示 。 (a)不對稱單位中有一個或多個分子； (b)分子由空間群對稱操作形成一組分子集合； (c)分子集合形成晶胞；(d)晶胞平移形成晶體 。 經(jīng)歷了整整 20年 ， 第一張完美的蛋白質(zhì)晶體 ― 胃蛋白酶 的 X 射線衍射照片才出世 。 第一個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)是 肯德魯 （ Kendrew ） 于 1957 年完成的 肌紅蛋白 的 nm 分辨率結(jié)構(gòu) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 同晶臵換法 的大意是：要對所研究的蛋白質(zhì)晶體中的分子做一點化學(xué)修飾 ， 即在分子的特定位臵上加入一些 重原子 。 當然 ， 這種化學(xué)修飾不能破壞晶體的周期排布性質(zhì) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 數(shù)據(jù)精度不夠就需要改進收集衍射數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備 。 使用 X 光膠片又引進了一系列誤差。 另一方面 ， 蛋白質(zhì)晶體學(xué)總是率先使用當代運轉(zhuǎn)最快速的電子計算機 ， 這是因為它所需要的運算量極大 ， 特別是對結(jié)構(gòu)模型的精化 ，沒有大容量 、 速度快的計算機是不行的 。 早期 ， 人們樂觀地看到在馬脾上滴幾滴硫酸鎘溶液就可以獲得一種蛋白質(zhì)晶體 ， 待到方法突破之后 ， 人們才真正體會到蛋白質(zhì)晶體的生長原來是結(jié)構(gòu)分析的一個瓶頸 。 所以 蛋白質(zhì)晶體生長技術(shù)也成了蛋白質(zhì)晶體學(xué)發(fā)展的一部分 。 光學(xué)顯微鏡使人們能見到肉眼見不到的東西 ， 這是因為和光波波長相當?shù)臉颖揪嚯x （ 如細胞器等 ） 可以作為光波的衍射光柵 ， 衍射線經(jīng)物鏡的組合聚焦 （疊加 ） 給出了一個實體的虛像 ， 然后經(jīng)目鏡放大 ， 人們就可以見到細胞器了 。 同時 ， 在富里衰加和時又需要解決位相問題 ， 這就使問題復(fù)雜化起來 。 比如 ， X光激光不斷向短波方向延伸 ， 就有可能發(fā)明 X光激光顯微鏡 ， 因為激光的位相已知 ， 將會使問題大大簡化 。 第三代同步輻射的應(yīng)用 ， 使晶體小到20~40nm的蛋白質(zhì)復(fù)合物等結(jié)構(gòu)得以測定并達到原子分辨率水平 。 同時 ， 由于極強的同步輻射光源加上極細的聚焦 ，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)研究成為可能 ， 如大分子酶在晶體中的催化過程 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 由于 X射線衍射分析技術(shù)的發(fā)展 ， 以及核磁共振 、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測等技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用 ， 使20 世紀末又誕生了一門新興學(xué)科 —— 結(jié)構(gòu)生物學(xué) 。 顯然 ， 結(jié)構(gòu)生物學(xué)在研究基因功能的戰(zhàn)略任務(wù)上將起到關(guān)鍵性的作用 。 這就要求發(fā)展 快速批量表達基因 的方法 ， 與蛋白質(zhì)純化 、 培養(yǎng)晶體 、 數(shù)據(jù)收集 、 分析結(jié)構(gòu)形成 ? 一條龍 ?， 使用最先進的軟件和技術(shù)使晶體結(jié)構(gòu)分析達到全自動化 。 實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的全自動化分析 （ 其中不僅是 X射線晶體結(jié)構(gòu)的全自動化分析 ， 還包括 NMR的全自動化分析 ） ， 是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的基本要求 ， 否則很難想象實現(xiàn)工業(yè)化大批量 ? 生產(chǎn) ? 蛋白質(zhì)的三維