【正文】 穩(wěn)定和將來的菌株退化。這個(gè)過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞， 這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。 二、誘變育種步驟 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。 3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。 2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。 大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。而用電離輻射177。 使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)： 大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。 化學(xué)誘變劑： 化學(xué)因子如堿基類似物、 5— 氟尿嘧啶、烷化劑等。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。 ? （ 四）篩 選 ? 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。在這 —步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。 （三）培養(yǎng)分離 ? 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。 ? 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。一般園田土 和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適 pH 值、提取工藝等。 ? 分離：利用分離技術(shù)得到純種。 ? 采樣：有針對性地采集樣品。 ? 有了 優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。人們能夠根據(jù)自己的意愿將微生物以外的基因件導(dǎo)入微生物 細(xì)胞中，從而達(dá)到定向地改變生物性狀與功能創(chuàng)新的物種，使發(fā)酵工業(yè)能夠生產(chǎn)出自然界微生物所不能合成的產(chǎn)物。對微生物具有高度專一性的酶反應(yīng)作為合成手段的一部分加以利用，進(jìn)行合理的代謝。人為地控制微生物的發(fā)酵進(jìn)程。 二、發(fā)酵工業(yè) 定義：是指利用生物的生命活動(dòng)產(chǎn)生的酶，無機(jī)或有機(jī)原料進(jìn)行酶加工，獲得產(chǎn)品的工業(yè)。 2. 通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。 如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出 CO2。 同時(shí)，也可以把發(fā)酵的微生物分離出來，通過人工培養(yǎng)，根據(jù)不同的要求去誘發(fā)各種類型的發(fā)酵，獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。 (5)由于 生物反應(yīng)的復(fù)雜性，在從實(shí)驗(yàn)室到中試，從中試到大規(guī)模生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)許多問題，這就是發(fā)酵工程工藝放大問題 微生物發(fā)酵技術(shù) ? 1857 年法國化學(xué)家、微生物家巴斯德提出了著名的發(fā)酵理論： “一切發(fā)酵過程都是微生物作用的結(jié)果。 發(fā)酵工程 主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生 產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù) (1) 有嚴(yán)格的無菌生長環(huán)境： 包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進(jìn)行滅菌的技術(shù)； 在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù)； (2)在發(fā)酵過程中根據(jù)細(xì)胞生長要求控制加料速度的計(jì)算機(jī)控制技術(shù)； (3)種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。發(fā) 酵 工 程 ? 發(fā)酵已經(jīng)從過去簡單的生產(chǎn)酒精類飲料、生產(chǎn)醋酸和發(fā)酵面包發(fā)展到今天成為生物工程的一個(gè)極其重要的分支，成為一個(gè)包括了微生物學(xué)、化學(xué)工程、基因工程、細(xì)胞工程、機(jī)械工程和計(jì)算機(jī)軟硬件工程的一個(gè)多學(xué)科工程。 ? 現(xiàn)代發(fā)酵工程不但生產(chǎn)酒精類飲料、醋酸和面包，而且生產(chǎn)胰島素、干擾素、生長激素、抗生素和疫苗等多種醫(yī)療保健藥物，生產(chǎn)天然殺蟲劑、細(xì)菌肥料和微生物除草劑等農(nóng)用生產(chǎn)資料，在化學(xué)工業(yè)上生產(chǎn)氨基酸、香料、生物高分子、酶以及維生素和單細(xì)胞蛋白等。 (4)在進(jìn)行任何大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵前，必須在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小發(fā)酵罐進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，得到產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)模型，并根據(jù)這個(gè)模型設(shè)計(jì)中試的發(fā)酵要求，最后從中試數(shù)據(jù)再設(shè)計(jì)更大規(guī)模生產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)模型。 ” ? 巴斯德認(rèn)為，釀酒是發(fā)酵，是微生物在起作用；酒變質(zhì)也是發(fā)酵，是另一類微生物在作祟；隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以用加熱處理等方法來殺死有害的微生物，防止酒發(fā)生質(zhì)變。 利用微生物的特點(diǎn) ? 發(fā)酵 工程所利用的微生物主要是細(xì)菌、放線菌，酵母菌和霉菌 利用微生物的特點(diǎn)： (1)對周圍環(huán)境的溫度、壓強(qiáng)、滲透壓、酸堿度等條件有極大的適應(yīng)能力 (2)有極強(qiáng)的消化能力 (3)有極強(qiáng)的繁殖能力 一、發(fā)酵的定義 傳統(tǒng)發(fā)酵 生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵 工業(yè)上的發(fā)酵 傳統(tǒng)發(fā)酵 最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過程 生化和生理學(xué)意義的發(fā)酵 指微生物在無氧條件下，分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴(yán)格地說，發(fā)酵是以有機(jī)物作為電子受體 的氧化還原產(chǎn)能反應(yīng)。 工業(yè)上的發(fā)酵 泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程 ， 包括： 1. 厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。 產(chǎn)品有細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也 有 菌體細(xì)胞、酶等。 ? 適宜的微生物 ? 保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件 ? 進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備 ? 精制成產(chǎn)品的方法的設(shè)備 三 、發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展歷史 ? 天然發(fā)酵階段 ? 純培養(yǎng)技術(shù)的建立：巴斯德，科赫等。 ? 通氣攪拌發(fā)酵技術(shù)的建立：青霉素的生產(chǎn) ——深層培養(yǎng) ? 代謝控制發(fā)酵技術(shù)：微生物進(jìn)行甾體化合物的轉(zhuǎn)化， Glu 和 Lys 發(fā)酵生產(chǎn)。 ? 開拓發(fā)酵原料時(shí)期：石油發(fā)酵，醋酸生產(chǎn)谷氨酸 ? 基因工程階段：采用酶學(xué)的方法，將不同來源的 DNA 進(jìn)行體外重組，再把重組DNA 設(shè)法轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行繁殖和遺傳下去。 第二章 生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏 第一節(jié) 菌種的分離簡介 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 ? 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。 三、新種分離與篩選的步驟 ? 定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 ? 增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 ? 發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。 （一）采樣 采樣對象 以采集土壤為主。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用 小 薩 子 除去 表 土 ，取 離 地 面515cm 處的土約 10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。 （二）增殖培養(yǎng) ? 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。因此還必須分離，純化。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。 （五）毒性試驗(yàn) ? 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。 七、生產(chǎn)選種 是在長年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些 批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。 第 二 節(jié) 誘變育種 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅 1061010 左右。 誘變 一、誘變劑和誘變處理 物理誘變劑：射線如紫外線、 X— 射線、γ— 射線，快中子 ； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。 化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。 化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣 罩。行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。 誘變劑的選擇 1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。 4．紫外 線仍十分有效。但它可能影響鄰近基因的性能。 2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。 4．出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選 2～ 3 株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。 (二 )處理菌懸液的制備 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。 (四 )中間 培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )，需 3 代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。 (五 )分離和篩選 篩選分初篩和復(fù)篩。 復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。 紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用 15W 紫外線殺菌燈，波長為 2537A．燈與處理物的距 離為 15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為 106 個(gè)／ml 左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為 106～ 107個(gè)／ ml。 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。 3．取 2～ 4m1 制備的菌液加到直徑 9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、 15W 紫外線下 30cm 處。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。 5．取照射菌液 2ml于液體培養(yǎng)基中 (300ml三角瓶內(nèi)裝 30ml 培養(yǎng)液 )， 120r／ min 振蕩培養(yǎng) 4～ 6h。 7．挑取菌落進(jìn)行篩選。 低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì) 2. 方法 （ 1）斜面保藏法：用螺旋口試管防失水，盡量減少碳源含量 （ 2）干燥保藏法：沙土管，固體曲 （ 3）懸液保藏法：將微生物懸浮在不含養(yǎng)分的溶液中 (水、生理鹽水、 buffer) （ 4）冷凍干燥保藏法：冷凍，減壓蒸發(fā)除去水分，使生命活動(dòng)停止 （ 5）低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在20℃以下的低溫中保藏，比冷凍干燥更為常用。 舉例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。 一、微生物的代謝產(chǎn)物 次級代謝產(chǎn)物 定義：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。 特征： 不同的微生物初級代謝產(chǎn)物不同； 抗生