【正文】 產(chǎn)生新的產(chǎn)物 五、基因工程育種 定向育種，技術(shù)含量高，應用面廣。 雜交方式：孢子與孢子；孢子與單倍體細胞；單倍體細胞間。 ４ .酵母菌的雜 交育種 雙單特性：存在單倍體和二倍體的生活史 二倍體生活力強，生產(chǎn)能力高，可通過雜交得二倍體來育種。 放線菌的雜交方法 混合培養(yǎng)法；平板雜交法；玻璃紙轉(zhuǎn)移法． 三、雜交育種 ３ .霉菌的雜交育種 準性生殖過程：不通過有性生殖的基因重組過程 異核體的形成；雜合二倍體形成；體細胞重組。獲部分合 子。 ①加誘導酶合成抑制物 ②交替培養(yǎng)法 ③顯色反應法 ４ .抗 （敏感）性突變株篩選 ?包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體 ①抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量 ②抗噬菌體突變：消除噬菌體污染 ③條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量 ④物敏突變：如氟乙酸敏感突變型，順烏頭酸 酶活性極低，異檸檬酸產(chǎn)量少， 檸檬酸積累。 突變株篩選 ?調(diào)節(jié)基因或操縱基因突變，產(chǎn)生的阻遏蛋白與不能結(jié)合或結(jié)合； ?結(jié)合，但不發(fā)生作用； ?結(jié)構(gòu)基因突變，使結(jié)構(gòu)酶無結(jié)合能力但有催化活性； 方法：末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物篩選； 營養(yǎng)缺陷型回復突變株篩選． ?突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因 ,解除對誘導物的依賴 ,可獲組成型突變株。 篩選的方法：通過選擇 /鑒別培養(yǎng)基加以識別。 影響誘變的因素：出發(fā)菌株； 誘變劑的種類與劑量。 二、誘變選育 ?誘導微生物發(fā)生突變進行的菌種選育，包括誘變和篩選兩個步驟。 ?原因：多因素低劑量的誘變效應； 互變異構(gòu)效應 ?結(jié)果：負變大于正變，應經(jīng)常分離純化 ?方法：菌懸液→平板分離→上搖瓶→檢測→ 選種→保藏 ?優(yōu)點：簡單易行，可與生產(chǎn)同步進行。 ?基因工程技術(shù) 第三章 微生物優(yōu)良菌種的選育 提綱 ?微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征 ?自然突變選育 ?誘變選育 原理 基本方法 ?雜交育種 細菌 放線菌 霉菌 酵母菌 ?原生質(zhì)體融合 ?基因工程技術(shù) 基因表達系統(tǒng) 利用大腸桿菌的基因表達系統(tǒng) 利用酵母菌的基因表達系統(tǒng) 基因工程菌的穩(wěn)定性 優(yōu)良菌種應具備的特征 ?對菌種的要求 ?生產(chǎn)力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產(chǎn) 物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少 ?操作性：培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離 ?穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強，菌種純粹，不易變異退化 ?安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素 優(yōu)良菌 種應具備的特征 ?選擇生產(chǎn)菌種應注意的因素 ：廣 , 轉(zhuǎn)化率高； ：目的產(chǎn)物含量高 , 副產(chǎn)物少； ：生長快、繁殖力強，耐受力強，抗污染、抗噬菌體能力強，遺傳特性穩(wěn)定 4. 設(shè)備方面 ：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。 ?微生物工業(yè)的特點： ?原料廣泛，產(chǎn)品豐富 ?在常溫、常壓下完成，設(shè)備簡單，通用性好 微生物發(fā)酵工業(yè)的范圍 ?釀酒工業(yè)（啤酒、葡萄酒、白酒等） ?發(fā)酵食品工業(yè)（醬、醬油、酸乳等） ?有機溶劑發(fā)酵工業(yè)（酒精、丙酮等 ） ?抗生素發(fā)酵工業(yè)（青霉素、鏈霉素等） ?有機酸發(fā)酵工業(yè)（檸檬酸、葡萄糖酸等） ?酶制劑發(fā)酵工業(yè)（淀粉酶、蛋白酶等） ?氨基酸發(fā)酵工業(yè)（谷氨酸、賴氨酸等） 微生物發(fā)酵工業(yè)的范圍 ?核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（肌苷酸等） ?維生素發(fā)酵工業(yè)（維生素 B12 等） ?生理活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（生物農(nóng)藥等） ?微生物菌體蛋白發(fā)酵（單細胞蛋白等） ?微生物環(huán)境凈化工業(yè)（污水處理） ?生物能工業(yè)（沼氣、纖維素等的利用） ?微生物冶金工業(yè)（微生物探礦、冶金等） 近代微生物工業(yè)的發(fā)展趨勢 ?簡單化合物（酒精） —復雜物質(zhì)（ SCP） ?自然發(fā)酵 —誘變與代謝 控制 —基因工程 ?化學合成 —生物合成 —生物與化學合成相結(jié)合 ?大型化、連續(xù)化和自動化的趨勢 ?石油、天然氣、纖維素等新原料的采用 微生物發(fā)酵工業(yè)的比擬放大問題 ?比擬放大問題： 實驗室小型試驗 (Laboratoryscale) 中間試驗規(guī)模 (Pilotscale) 大型生產(chǎn)規(guī)模 (Production) ?（小試 —中試 —生產(chǎn)） 本章知識結(jié)構(gòu) ?★微生物工程的定義與內(nèi)容 ?微生物工程的發(fā)展階段 ?★微生物工業(yè)的定義與特點 ?微生物工業(yè)的范圍 ?★近代微生物工業(yè)的發(fā)展趨勢 ?★微生物工業(yè)中的比擬放大問題 預 習內(nèi)容 —微生物工業(yè)菌種的來源 ?生物物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選過程 ?菌種分離的方法 第二章 微生物工業(yè)菌種的來源 提綱 ?生物物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選 ? 微生物是生物活性物質(zhì)的豐富資源 ? 標本采集 ? 標本預處理 ? 菌種的分離 ? 施加選擇壓力分離法 ? 隨機分離法 一、生物物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選 ?微生物工程工業(yè)生產(chǎn)三要素 ?生產(chǎn)菌種 ?生產(chǎn)工藝 (發(fā)酵、提取 ) ?生產(chǎn)設(shè)備 ?菌種篩選流程 取樣→預處理→富集培養(yǎng) →初篩 → 復篩→ 鑒定→保藏 １、微生物是生物活性物質(zhì)的豐富資源 ?分布廣種類多適應極端環(huán)境而進 化出許多特殊生理活性物質(zhì)； ?在那里篩選？如何篩選？ ? 目的產(chǎn)物性質(zhì)； ? 產(chǎn)生菌分布、特性、生態(tài)環(huán)境； ? 高選擇性篩選法。 發(fā)酵機理 ?發(fā)酵：厭氧或兼性厭氧微生物在厭氧條件 (anaerobic condition)下的主要產(chǎn)能方式，在這種方式中，有機物既是被氧化的基質(zhì)又是最終的電子受體 (electron acceptor)。 是微生物學、生物化學和 化學工程學等多學科相結(jié)合的交叉性學科。 第一章 微生物工程概論 微生物工程 Microbe Engineering 課程安排 ?緒論 ?生產(chǎn)菌種的來源 ?優(yōu)良菌種選育 ?菌種保藏原理和方法 ?微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程 ?培養(yǎng)基 ?發(fā)酵工藝控制 ?發(fā)酵過程的參數(shù)檢測和自動控制 ?微生物反應動力學下游處理 ?微生物工程 下游加工工程 ?微生物工程生產(chǎn)設(shè)備 ?微生物工程生產(chǎn)舉例 抗生素 氨基酸 檸檬酸 污水的生物處理 參考書目 ?微生物工程，曹軍衛(wèi)，科學出版社 ?微生物工程工藝原理，姚汝華， 華南理工大學出版社 ?當代食品生產(chǎn)技術(shù)叢書，化學工業(yè)出版社 ?生物制藥工藝學，吳梧桐，中國醫(yī)藥科技出版社 ?環(huán)境工程微生物學，周群英，高等教育出版社 第一章 微生物工程概論 提綱 ?微生物工程的概念 ?微生物工程的發(fā)展簡史 ?微生物工程的應用 微生物工程的概念 ?利用微生物的生長和代謝活動產(chǎn)生的各種生理活性物質(zhì)來生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品的工程技術(shù)。 利用生物特性和發(fā)酵理論，通過現(xiàn)代化的工程技術(shù)手段，進行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，使受培養(yǎng)的微生物或動植物細胞積累所需產(chǎn)品的一門技術(shù)學科。 微生物工程的基本內(nèi)容 ?微生物工程基本上可分為發(fā)酵和提純兩大部分 ?發(fā)酵部分：菌種的特性與選育，培養(yǎng)基的特性，滅菌理論，發(fā)酵機理，發(fā)酵動力學，連續(xù)發(fā)酵控制和自動化理論等； ?提純部分（后處理）：細胞破碎，過濾，沉淀，色譜，萃取，蒸發(fā)，結(jié)晶，干燥，包裝等。 微生物工程的發(fā) 展階段 ?自然發(fā)酵時期【釀酒、釀醋、制醬等】 ―藍色紀念碑 ‖、裴李崗遺址、龍山文化 ?純培養(yǎng)技術(shù)的建立 【發(fā)明顯微鏡（ 1667）、巴斯德消毒法、純培養(yǎng)技術(shù)】 ?通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術(shù)的建立 【青霉素的發(fā)現(xiàn)（ 1929）和大量生產(chǎn)（ 1945）】 ?人工誘變育種與代謝控制技術(shù)的建立 【用發(fā)酵法制造谷氨酸（ 1956）等氨基酸】 微生物工程的發(fā)展階段 ?DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)（ 1953） 基因工程的介入 ?發(fā)酵連續(xù)化、自動化技術(shù)的建立 【結(jié)合數(shù)學、動力學、化學工程原理、計算機技術(shù)和自動控制理論】 ?微生物酶反應 生物合成和化學合成相結(jié)合的工程技術(shù)的建立【維生素 C 生產(chǎn)】 【化學合成：適用于低分子有機物生產(chǎn)； 發(fā)酵：適用于生產(chǎn)復雜物質(zhì)和有立體特異性的物質(zhì)，設(shè)備簡單，通用性好，但周期長，濃度低】 微生物工業(yè)的定義與特點 ?微生物工業(yè)的定義：又稱發(fā)酵工業(yè)，是利用微生物具有的化學活性進行物質(zhì)轉(zhuǎn)換，從事各種發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的工業(yè)。 標本采集 ?極端環(huán)境中存在適應環(huán)境壓力的菌群 (高溫、高壓、高鹽、高 PH、低 PH、深海 ) ?土壤中菌種資源最豐富， 不同土壤中含微生物種群不同 ?特殊環(huán)境中可得到某些特定的類群 難降解物、毒物水 —分解微生物； 死蟲腸道－蘇云金桿菌； 煉油廠附近土－石油分解菌 ３、標本預處理 ?提高分離幾率 ?方法 物理法 （溫度、膜過濾） 化學法 誘餌法 （頭發(fā)、蛇皮、花粉） 二、菌種的分離 ?人為控制條件，利于目的菌，不利其他菌 （溫度、 PH、滲透壓、氧、碳源、氮源） ?加抗生素或試劑 ?選擇培養(yǎng)基中加入酶作用底物，產(chǎn)酶者長 ?重復使用多種選擇壓力轉(zhuǎn)種 ?控制限制性基質(zhì)稀釋率的連續(xù)培養(yǎng) 來富集菌種 二、菌種的分離 ２ .隨機分離法 ?抗生素－抑菌圈法稀釋法擴散法生物自顯影法 ?抗腫瘤藥物－ BIA 法、 SOS 法 ?酶抑制劑－ ―靶酶 ‖篩選法 ?抗病毒藥物－檢測病毒特有的 DNA 復制酶、 核酸合成酶抑制劑 ?生長因子－影印法 本章知識結(jié)構(gòu) 微生物是生物活性物質(zhì)的豐富資源 標本采集 ★ 標本預處理 4 、 ★ 施加選擇壓力分離法 5 、隨機分離法 預習內(nèi)容 —微生物優(yōu)良菌種 的選育 ?微生物優(yōu)良生產(chǎn)菌種的特征 ?誘變選育菌種的分離 ?雜交選育方法。 （培育條件異，周期短，需氧量小，抗污染能力強） 一、自然選育 ?利用微生物自然突變進行的菌種選育。 ?缺點：頻率低， 108—109 /次分裂。 ?原理：染色體畸變；基因突變。 誘變劑：能提高基因突變頻率的物理、化學、生物因子。 初篩→復篩→確定最佳發(fā)酵條件 １ .營養(yǎng)缺陷型突變株篩選 ?酶缺陷，結(jié)果造成中間產(chǎn)物積累； ?解除協(xié)同反饋，使另一分支末端產(chǎn)物積累； ?滲漏型 突變（酶未完全喪失活性，下降），末端產(chǎn)物少，中間產(chǎn)物積累。 ?篩選方法：設(shè)計條件使組成型優(yōu)勢生長，或通過菌落分辨。 三、雜交育種 借助有性重組，使不同菌株的遺傳物質(zhì)得以交換 方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、 F 因子轉(zhuǎn)導、 R 因子轉(zhuǎn)移、接合。 出發(fā)菌株需帶遺傳標記：營養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫敏、發(fā)酵性能 基因重組過程近似細菌，育種方法與霉菌相似． 放線菌的遺傳體系和雜交原理 異核現(xiàn)象；接合現(xiàn)象；異核系的形成；重組體的形成。 霉菌的雜交技術(shù)：誘變獲具標記的親本 異核體的形成；雙倍體檢出；分離子檢出。 方法：獲單倍體細胞；雜交。 四、原生質(zhì)體融合育種 借助原生質(zhì)融合技術(shù)實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的交換 １ .原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性： 受限制??； 重組頻率高； 遺傳物質(zhì)傳遞更充分； 可先用理化因子處理； 其誘變率更高。 ?應用：解決了一些藥物或材料來源困難，或制造技術(shù)復雜，或造價昂貴而無法大量生產(chǎn)和應用的問題。 ?工業(yè)生產(chǎn)的意義： 基因的表達產(chǎn)量； 表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性； 產(chǎn)物的生物活性； 產(chǎn)物分離純化。 １ .原核表達系統(tǒng)；２ .真核表達系統(tǒng)． ?原核生物不適宜表達需后加工處理的那一部分真核基因 不能切除 mRNA 的內(nèi)含子； 不能進行蛋白質(zhì)的糖基化； 不能對氨基酸進行修