【正文】 驗(yàn)室的衛(wèi)生值日工作。 ⑾ 每組的儀器和玻璃器皿要用油漆編號(hào)，嚴(yán)禁抄拿 他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計(jì)內(nèi)和其他實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，打破了玻璃儀器要及時(shí)向教師報(bào)告，并自覺登記，學(xué)期結(jié)束時(shí)按規(guī)定進(jìn)行處理。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良?xì)馕兜膶?shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行。儀器發(fā)生故障應(yīng)立即報(bào)告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。使用分光光度計(jì)時(shí)不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。電泳后的凝膠和各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。 ⑹ 配制的試劑和實(shí)驗(yàn)過程中的樣品，尤其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標(biāo)簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴(yán)密封口。 ⑷ 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、稱量臺(tái)、藥品架、水池以及各種實(shí)驗(yàn)儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴(yán)禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是 NaOH）灑落在天平和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。若想改進(jìn)和設(shè)計(jì)新的實(shí)驗(yàn)方法，必須取得教師的同意。 ⑵ 實(shí)驗(yàn)時(shí)自覺遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑和喧嘩。 由近百年來生物化學(xué)及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展史可以看出，該學(xué)科的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)，每一種新的生化物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與研究都離不開實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)每一次新的發(fā)明都大大推動(dòng)了生物化學(xué)研究的進(jìn)展， 因而對(duì)于每一位現(xiàn)代生物科學(xué)工作者，尤其是生物化學(xué)工作者，學(xué)習(xí)并掌握各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)就是極為重要的。 1965 年我國(guó)化學(xué)和生物化學(xué)家用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素， 1983 年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合 ４ 成。 1995 年，美國(guó)科學(xué) 家 Lewis、德國(guó)科學(xué)家 NussleinVolhard 和美國(guó)科學(xué)家 Wieschaus 由于在 20 世紀(jì) 40～ 70 年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1993 年，美國(guó)科學(xué)家 Roberts 和 Sharp 由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1988 年，美國(guó)遺傳學(xué)家 McClintock 由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。他們 3 人共獲 1969 年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 美國(guó)生物化學(xué)家 Nirenberg 在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)， Holly 闡明了酵母丙氨酸 tRNA 的核苷酸排列順序，后來證明所有 tRNA 的結(jié)構(gòu)均相似。 1959年，美藉西班牙裔科學(xué)家 Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過 RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。 英藉德裔生物化學(xué)家 Krebs，在 1937 年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對(duì)細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家 Lipmann 共獲 1953 年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 除上述歷史以外，還可以列出許多生物化學(xué)發(fā)展史上的重要成就，例如： 美國(guó)哈佛大學(xué)的 Folin 教授和中國(guó)的吳憲教授對(duì)生物化學(xué)常用的各種分析方法（血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測(cè)定等）的建立作出了歷史性的貢獻(xiàn)。 1984 年德國(guó)科學(xué)家 Kohler、美國(guó)科學(xué)家 Milstein 和丹麥科學(xué)家 Jerne 由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1981 年由 Jenson 和 Lukacs 首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（ HPCE） ，由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實(shí)驗(yàn)技 ３ 術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)。 80 至 90 年代 ： 基因工程技術(shù)進(jìn)入輝煌發(fā)展的時(shí)期， 1980 年，英國(guó)劍橋大學(xué)的生物化學(xué)家 Sanger 和美國(guó)哈佛大學(xué)的 Gilbert 分別設(shè)計(jì)出兩種測(cè)定 DNA 分子內(nèi)核苷酸序列的方法，而與 Berg 共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，從此， DNA 序列分析法成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)最重要的研究手段之一。 1973 年，又由美國(guó)斯坦福大學(xué)的 Cohen 等人第一次完成了 DNA 重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年， Cohen 成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。 1969 年 Weber 應(yīng)用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測(cè)定了蛋白質(zhì)的分子量，使電泳技術(shù)取得了重大進(jìn)展。在 X射線衍射技術(shù)方面，英國(guó)物理學(xué)家 Perutz 對(duì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行 X射線結(jié)構(gòu)分析 , Kendrew 測(cè)定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子空間立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲 1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1967 年 Edman 和 Begg 制成了多肽氨基酸序列分析儀，到 1973 年 Moore 和 Stein 設(shè)計(jì)出氨基酸序列自動(dòng)測(cè)定儀，又大大加快了對(duì)多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，十多年間氨基酸的自動(dòng)測(cè)定工作得到了很大的發(fā)展和完善。 60 年代 ： 各種儀器分析方法用于生物化學(xué)研究，取得了很大的發(fā) 展，如 HPLC 技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、 NMR 核磁共振技術(shù)等。 “電泳技術(shù)”是由瑞典的著名科學(xué)家 Tisellius 所奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了 1948 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 40 年代 ： 層析技術(shù)大發(fā)展，兩位英國(guó)科學(xué)家 Martin 和 Synge 發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了 1952 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。瑞典著名的化 學(xué)家 奠基了“超離心技術(shù)”， 1924 年制成了第一臺(tái) 5000 g（ 5000 r/min～ 8000 r/min）相對(duì)離心力的超離心機(jī) (相對(duì)離心力 “RCF”的單位可表示 ２ 為 “ g”)，開創(chuàng)了生化物質(zhì)離心分離的先河，并準(zhǔn)確測(cè)定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了 1926 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這里我們簡(jiǎn)單回顧一下生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展歷史。 ⑷ 掌握生物化學(xué)的各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，尤其是各 種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今后參加科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 ⑵ 訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器，包括各種天平、各種分光光度計(jì)、各種離心機(jī)、自動(dòng)部分收集器、恒流泵、核酸蛋白檢測(cè)儀、冰凍干燥機(jī)、酸度計(jì)、電導(dǎo)率儀、高速分散器、各種電泳裝置和搖床等等。實(shí)驗(yàn)中所用到的各種技術(shù)和方法，將起到“眼睛”的作用，用以對(duì)各種生物化學(xué)過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大家會(huì)發(fā)現(xiàn)，極少有像無機(jī)化學(xué)和有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)菢舆M(jìn)行化學(xué)反應(yīng)和分離出“克”數(shù)量級(jí)的產(chǎn)物。同學(xué)們?cè)谏锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)方面要取得好成績(jī)，在很大程度上，取決于你們對(duì)這 些專門化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的熟練掌握和對(duì)生物化學(xué)原理的深入了解。 １ 〔Ⅰ〕 理論部分 1. 緒論 歡迎同學(xué)們到生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室來！對(duì)于大多數(shù)學(xué)生來說，這不是第一次做化學(xué)實(shí)驗(yàn)，但是我們相信，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)一定是大家最感興趣、最激動(dòng)人心的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然也是花費(fèi)最大、最辛苦的實(shí)驗(yàn)。同學(xué)們?cè)谶^去幾年中所學(xué)到的各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和操作技能，在這些實(shí)驗(yàn)中將會(huì)經(jīng)常用到，當(dāng)然更重要的是要學(xué)會(huì)一些新的、在生物化學(xué)的科學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法。 當(dāng)同學(xué)們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，無疑將會(huì)與以前做的各種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較。同學(xué)們將進(jìn)行的是“毫克”和“微克”數(shù)量級(jí)的研究，并且在多數(shù)情況下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物質(zhì)，但是將會(huì)看到動(dòng)態(tài)的生物化學(xué)過程和由生物分子引起的生物化學(xué)變化。 同學(xué)們通過生物化學(xué)實(shí) 驗(yàn)應(yīng)該做到： ⑴ 學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思路，掌握各個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自己的實(shí)驗(yàn)，合理地安排實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。 ⑶ 學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)作風(fēng)。 預(yù)祝同學(xué)們以優(yōu)異的成績(jī)跨進(jìn)這一新的科學(xué)殿堂，成為攀登生物科學(xué)高峰的新的勇士！ 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 生物科學(xué)在 20 世紀(jì)有驚人的發(fā)展，其中生物化學(xué)與分子生物學(xué)的進(jìn)展尤為迅速，這樣一門最具活力和生氣的實(shí)驗(yàn)科學(xué)，在 21 世紀(jì)必將成為帶頭的學(xué)科，這主要有賴于生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善。 20 年代 ： 微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。 30 年代 ： 電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生物大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。 50 年代 ： 自 1935 年 Schoenheimer 和 Rittenberg 首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，“放射性同位素示蹤技術(shù)”在 50 年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學(xué)代謝過程的闡明起了決定性的作用。自 1958 年 Stem， Moore 和 Spackman 設(shè)計(jì)出氨基酸自動(dòng)分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。 1962 年，美國(guó)科學(xué)家 Watson 和英國(guó)科學(xué)家 Crick 因?yàn)樵?1953 年提出的 DNA 分子反向平行雙螺旋模型而與英國(guó)科學(xué)家 Wilkins 分享了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，后者通過對(duì) DNA 分子的 X射線衍射研究證實(shí)了 Watson 和 Crick 的 DNA模型，他們的研究成果開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。 此外，在 60 年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進(jìn)展，在 1968— 1972 年 Anfinsen 創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。 70 年代 ： 基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展， Arber， Smith 和 Nathans 三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶， 1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的 Berg 等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了 DNA 分子，并實(shí)現(xiàn)了 DNA 分子的重組。與此同時(shí) ，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了 DNA序列測(cè)定儀、 DNA 合成儀等。他們 3 人在 DNA 重組和 RNA 結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。現(xiàn)今，由于 HPCE 技術(shù)的異軍突起， HPLC 技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。 1985 年美國(guó)加利福尼亞州 Cetus 公司的 Mullis 等發(fā)明了 PCR 技術(shù)（ Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 DNA 擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的 Smith共享 1993 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 美國(guó)化學(xué)家 Pauling 確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用 的重要性等，他獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 英國(guó)生物化學(xué)家 Sanger 還于 1953 年確定了牛胰島素中氨基酸的精確順序而獲得 1958 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他和 Kornberg 分享了當(dāng)年的諾 貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，而后者的主要貢獻(xiàn)在于實(shí)現(xiàn)了 DNA 分子在細(xì)菌細(xì)胞和試管內(nèi)的復(fù)制。美藉印度裔生物化學(xué)家 Khorana 曾合成了精確結(jié)構(gòu)的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。 法國(guó)生物學(xué)家 Lwoff、 JAcob 和生物化學(xué)家 Monod 由于在病毒 DNA 和 mRNA 等方面出色的大量研究工作而共獲1965 年諾貝爾生理 醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1989 年，美國(guó)科學(xué)家 Altman 和 Cech 由于發(fā)現(xiàn)某些 RNA 具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1994 年，美國(guó)科學(xué)家 Gilman 和 Rodbell 由于發(fā)現(xiàn)了 G 蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 我國(guó)生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在 20 年代初由美回國(guó)后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。近年來，在酶學(xué) 研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 ⑴ 實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，明確本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求，掌握實(shí)驗(yàn)原理，寫好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告，否則，不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 ⑶ 實(shí)驗(yàn)過程中要聽從教師指導(dǎo)，認(rèn)真按照實(shí)驗(yàn)步驟和操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)整理數(shù)據(jù)，按時(shí)上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 ⑸ 配制 試劑和用無離子水要注意節(jié)省，按實(shí)驗(yàn)實(shí)際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機(jī)試劑要按教師要求進(jìn)行回收，昂貴的 Sephadex、 Sepharose 凝膠和 DEAE 纖維素等，用后必須及時(shí)回收，不得丟棄。 ⑺ 配制和使用洗液必須極為小心，強(qiáng)酸強(qiáng)堿必須倒入廢液缶或沖稀后排放。 ⑻ 使用貴 重精密儀器應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。使用高速冷凍離心機(jī)和 ＨＰＬＣ 等大型儀器必須經(jīng)過考核。 ⑼ 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、飲水和進(jìn)食， 嚴(yán)禁用嘴吸移液管和虹吸管。 ⑽ 實(shí)驗(yàn)完畢必須及時(shí)洗凈并放好各種玻璃儀器，插好自動(dòng)部分收集器上的試管，保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)的整潔。 ⑿ 每位學(xué)生要熟悉實(shí)驗(yàn)室內(nèi)電閘的位置，烘箱和電爐用畢必須立即斷電，不得過夜使用， 要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室安全用電規(guī)則和其他安全規(guī)則。最后離開實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。因 此每一位在生化實(shí)驗(yàn)室工作的人員都必須有充分的安全意識(shí)，嚴(yán)格的防范措施和豐富實(shí)用的防護(hù)救治知識(shí)，一旦發(fā)生意外能正確地進(jìn)行處置，以防事故進(jìn)一步擴(kuò)大。常用有機(jī)溶劑的易燃性列表如下：