【正文】 ⑥生物大。④生物材料的破碎和預(yù)處理。②建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵，因?yàn)樗钦麄€(gè)分離純化過程的“眼睛”。 由于生物大分子的分離和制備是如此的復(fù)雜和困難，因而實(shí)驗(yàn)方法和流程的設(shè)計(jì)就必須盡可能多查文獻(xiàn)，多參照前人所作 的工作，吸取其經(jīng)驗(yàn)和精華，探索中的失敗和反復(fù)是不可避免的，只有具有百折不撓的鉆研精神才能達(dá)到預(yù)期的目的。過酸、過堿、高溫、劇烈的攪拌、強(qiáng)輻射及本身的自溶等都會(huì)使生物大分子變性而失活，所以分離純化時(shí)一定要選用最適宜的環(huán)境和條件。例如由腦垂體組織取得某些激素的釋放因子，要用幾噸甚至幾十噸的生物材料，才能提取出幾毫克的樣品。 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，只有萬分之一、幾十萬分之一，甚至幾百萬分之一。其中許多化合物至今還是個(gè)謎，有待人們研 ２４究與 開發(fā)。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工作，有時(shí)制備一種高純度的蛋白質(zhì)、酶或核酸，要付出長期和艱苦的努力。 2. 生物大分子的制備 概述 生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、酶（也是一種蛋白質(zhì)）和核酸，這三類物質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 由上述內(nèi)容可見，生化實(shí)驗(yàn)室所需裝備的各種儀器設(shè)備和設(shè)施是多種多樣的，因而要求每一位生物化學(xué)工作者和學(xué)生都必須非常重視這些儀器設(shè)備和設(shè)施的使用和維護(hù)，必須具有較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力。 ⑼普通顯微鏡和倒置顯微鏡：用于對各種細(xì)胞和生物材料的觀察。 ⑺機(jī)械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。 ⑸制冰機(jī)：為實(shí)驗(yàn)室提供足夠的碎冰塊。 ⑶組織打碎機(jī)和勻漿器：用于各種生物材料、動(dòng)植物組織和細(xì)胞的破碎。 其他設(shè)備 ２３ 實(shí)驗(yàn)室除以上常規(guī)設(shè)備和設(shè)施外，還必須裝備下列一些常用設(shè)備： ⑴通風(fēng)柜：用于有害和有毒氣體的操作。 暗室中應(yīng)裝備有：照相裝置、放大機(jī)、曝光箱、翻拍儀、自動(dòng)沖片 機(jī)和紫外透射儀等。 高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀 用于各種生物大分子的分析與鑒定。 基因?qū)雰x 用于向 受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入基因。 動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物培養(yǎng)：需要二氧化碳培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱和動(dòng)物房等。 微生物培 養(yǎng)：需要恒溫恒濕培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器即搖床（有空氣和水浴式以及全溫式搖床）、發(fā)酵罐、大型生物反應(yīng)器等。生物材料的培養(yǎng)有微生物培養(yǎng)、植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物培養(yǎng)等。 ⑸廢物處理器：使用同位素應(yīng)有能夠安全地存放和處理同位素廢物的場所，否則嚴(yán)禁使用同位素。 ⑷放射性核素分析測定儀：用來檢測分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ⑵操作時(shí)的防護(hù)設(shè)施： 常用的器具有：有機(jī)防護(hù)并、特制防護(hù)衣、防護(hù)罩等．接觸同位素樣品時(shí)必須戴防護(hù)手套。 ２２ 同位素實(shí)驗(yàn)設(shè)施 生物化學(xué)許多實(shí)驗(yàn)都要用到放射性同位素，如：生物體分子示蹤、分子雜交、放射性檢測等，因此實(shí)驗(yàn)室必須有安全的同位素實(shí)驗(yàn)設(shè)施。該反應(yīng)是 用 DNA 聚合酶在體外大量擴(kuò)增 DNA 片段的一種方法。 蛋白質(zhì)的自動(dòng)合成與測序儀 用于蛋白質(zhì)分子的體外合成與序列測定。 真空印跡系統(tǒng) 該設(shè)備是一種利用真空原理將已經(jīng)分離 的生物大分子 (蛋白質(zhì)、核酸 )從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上的儀器，主要由印跡儀和真空印跡泵組成，印跡效率接近 100％，重復(fù)性好，方法簡易、快速，將轉(zhuǎn)移分子的變性、中和、印跡等所有步驟均在印跡儀中完成，從而避免了凝膠受損。 光密度儀 激光光密度儀是適用于多種電泳結(jié)果分析的儀器。 層析裝置 層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測器就是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的儀器設(shè)備。 電泳裝置 電泳是生化實(shí)驗(yàn)中最常用最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。 離心設(shè)備 離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實(shí)驗(yàn)室必須備有各種形式的離心機(jī)。 ⑷ 液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計(jì)的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通 過測定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來計(jì)算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計(jì)就是生化實(shí)驗(yàn)室必備的儀器分析手段。 ⑵ 液體體積度量系統(tǒng)：常用的有各種量筒、移液管、容量并、微量進(jìn)樣器和各種自動(dòng)取液器等。常用的定量系統(tǒng)有： ２１ 稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、 pH 測定系統(tǒng)、 液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)等。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種無菌處理設(shè)備。 所有的各種純水，在貯存中都會(huì)被污染：塑料容器會(huì)產(chǎn)生有紫外吸收的有機(jī)物；玻璃和金屬容器會(huì)產(chǎn)生金屬離子的污染；長時(shí)間放置更會(huì)使水長菌，空氣中的二氧化碳會(huì)溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴(yán)，必要時(shí)貯存 在冰箱的冷藏室中。不含金屬離子的水，需用亞沸蒸餾水，即用石英亞沸蒸餾器進(jìn)行蒸餾，其特點(diǎn)是在液面上方加熱，但水并不沸騰，只是液面處于亞沸狀 態(tài)，可將水蒸氣帶出的雜質(zhì)減至最低，但制水量較小，每小時(shí)約 1～ 4 升。 實(shí)驗(yàn)室中制備蒸餾水，多采用石英管加熱的硬質(zhì)玻璃蒸餾水器，蒸餾時(shí)不能用自來水，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生水垢，最好用無離子水作為水源。無離子水的水質(zhì)用電阻率表示，最高純度是 18 MΩ cm（ 25℃）。在超純分析和特殊 的生化實(shí)驗(yàn)中要求更高的水質(zhì)，如 15～ 18 MΩ cm 高純無離子水、無熱源高純水、無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。生化實(shí)驗(yàn)對所用水的純度是要求比較高的，通?？梢哉J(rèn)為，水的質(zhì)量越高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就越真實(shí)可靠和準(zhǔn)確，為此必須保證實(shí)驗(yàn)用水的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)備有干冰，以便使用乙醇～干冰浴進(jìn)行樣品的快速冷凍分裝。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存， 實(shí)驗(yàn)室必須備有 4℃、－20℃、－ 80℃的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。 生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備 溫度與環(huán)境設(shè)施 ２０ 許多生化實(shí)驗(yàn)都要求在一定的溫度和濕度下進(jìn)行操作，因此，一個(gè)正規(guī)的生化實(shí)驗(yàn)室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常配制比使用濃度高十倍的“貯液”，使用時(shí)再稀釋到所需濃度，由于濃度變化很大，溶液 pH 會(huì) 有變化，因而稀釋后仍需對其 pH 進(jìn)行調(diào)整。為減少 Na+ 對 pH 測定的干擾，每個(gè)復(fù)合電極都應(yīng)附有一條校正 Na+干擾的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有的新式的復(fù)合電極具有 Na+ 不透過性能，如無以上兩個(gè)條件，則可以將電極內(nèi)的KCl 換成 NaCl。 pH 測定時(shí)會(huì)有幾方面的誤差： ⑴鈉離子的干擾：多數(shù)復(fù)合電極對 Na+ 和 H+ 都非常敏感，尤其是高 pH 值的堿性溶液， Na+ 的干擾更加明顯。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。 ⑹電極的玻璃泡容易被污染。校正時(shí)先將電極放入 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用 pH 計(jì)上的“標(biāo)準(zhǔn)”旋鈕校正 pH 讀數(shù)，然后取出電極洗凈，再放入 或 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用“斜率”旋鈕校正 pH 讀數(shù)，如此反復(fù)多次，直至二點(diǎn)校正正確，再用第三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液檢查。 ⑸使用前要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正電極，其數(shù)據(jù)見書后附錄，常用的三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液是 pH=、 和 （ 20℃），精度為177。 ⑶復(fù)合電極長期不用，可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中，平時(shí)可浸泡在無離子水或緩沖溶液中，使用時(shí)取出，用洗并沖洗玻璃泡部分，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待測溶液中，稍加攪拌，讀數(shù)時(shí)電極應(yīng)靜止 不動(dòng)，以免數(shù)字跳動(dòng)不穩(wěn)定。 (A) 玻璃電極 (B) 復(fù)合電極 (C) 參比電極（銀－氯化銀電極） 圖 1－ 3 pH 電極示意圖 測定 pH 值時(shí)，玻璃電極和參比電極同時(shí)浸入溶液中，構(gòu)成一個(gè)“全電池”，如下圖所示： pH 計(jì) １９ Ag/AgCl HCl( ) 樣品 4mol/L KCl 或 Ag/AgCl 或 溶液 飽和 KCl Hg/HgCl 玻璃電極 參比電極 使用時(shí)應(yīng)注意： ⑴經(jīng)常檢查電極內(nèi)的 4mol/L KCl 溶液的液面，如液面過低則應(yīng)補(bǔ)充 4mol/L KCl 溶液。使用飽和 KCl 是為使電極內(nèi)沉積有部分 KCl 結(jié)晶，以使 KCl的飽和濃度不受溫度和濕度的影響。常用的參比電極是甘汞電極（ Hg/HgCl）或銀 — 氯化銀電極（ Ag/AgCl）。當(dāng)玻璃電極浸入樣品溶液時(shí)，薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)的電位差取決于溶液的 pH，即玻璃電極的電極電位隨樣品溶液 １８中氫離子濃度（活度）的變化而變化。過去是使用兩個(gè)電極，即玻璃電極和參比電極（甘汞或銀 — 氯化銀電極），現(xiàn)在它們已淘汰，被兩種電極合一的復(fù)合電極所代替。試紙要存放在有蓋的容器中，以免受到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各種氣體的污染。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。另一種是精密 pH 試紙，可以較精確地測定溶液的 pH 值，其變色范圍是 2～ 3 個(gè) pH 單位，例如有 pH=～ 、 ～ 、 ～ 、 ～ 、 ～ 、 ～ 等許多種，可根據(jù)待測溶液的酸、堿性選用某一范圍的試紙。 pH 值的測定 測定溶液 pH 值通常有兩種 方法，最簡便但較粗略的方法是用 pH 試紙，分為廣泛和精密 pH 試紙兩種。 Good’s 緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對 pH 敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。 ⑹ 兩性離子緩沖液（ Zwitterionic buffers），又稱 Good’s 緩沖液 1960 年， 和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu) 缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計(jì)和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。 ⑸ 氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于 pH=～ ，例如最常用的有： 甘氨酸 — HCl 緩沖液： pH=～ ， 甘氨酸 — NaOH 緩沖液： pH=～ ， 甘氨酸 — Tris 緩沖液： pH=～ ，（此緩沖液用于廣泛使用的 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液： pH=～ ， 甘氨酰胺（ glycine amide）緩沖液： pH=～ ， 甘氨酰甘氨酸（ glycylglycine）緩沖液： pH=～ 。 有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（ Fe3+、 Zn++、 Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與 Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有 Ca++離子時(shí)，不能用這類緩沖液。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個(gè) pKa 值： pKa1＝ ， pKa2＝ ， pKa3＝ 。 ⑶ 有機(jī)酸緩沖液 這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成， pH 范圍為酸性，即 pH＝ ～ ，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。 ③易吸收空氣中的 CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 TrisHCl 緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是： ①因?yàn)?Tris 堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制 pH 范圍由酸性到堿性的大范圍 pH 值的緩沖液；②對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。 Tris 緩沖液的常用有效 pH 范圍是在“中性”范圍，例如： TrisHCl 緩沖液： pH＝ ～ Tris磷酸鹽緩沖液： pH＝ ～ 配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制 HCl 溶液，然后按表中所列體積混合。 其缺點(diǎn)為：①易與常見的 鈣 Ca++離子、鎂 Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對某些酶的催化作用會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。 用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用磷酸 １６鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)?SDS（十二烷基硫酸鈉）會(huì)與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。 按