【正文】 ][ ][lglg]lg [ HAAKH a?? ? ＋－－ (13) (13)式中： [HA] — 為弱酸的濃度 [H+] — 為 HA 解離出的氫離子濃度 [A— ] — 為 HA 的共軛堿的離子濃度 K1 — 為酸解離的速度常數(shù) K2 — 為 A— 與 H+ 締合的速度常數(shù) Ka — 為反應方程 (11)達平衡時 HA 的解離平衡常數(shù) １５ 現(xiàn)將 HA 的 pKa 定義為 － lg Ka，將 HA 溶液的 pH 定義為 － log[H+]， ∴ (13)式可寫為 ： ][ ][lg HAApKpH a?? ＋ (14) 或： ][ ][lg 未離解形式 離解形式＋apKpH ? (15) 方程 (14)稱為： HendersonHasselBalch 方程，此方程對于生物化學學 科，在理論與實踐上都具有重要意義。很明顯，當 [A— ]＝ [HA]時： 0][ ][lg ??HAA ∴ pH ＝ pKa 這就意味著當 [HA]有一半解離時，溶液的 pH 等于 pKa，此弱酸－堿緩沖體系的 pKa 即代表緩沖范圍的中點。 1，所以，當 緩沖溶液的 pH 等于該緩沖劑的 pKa 時，緩沖能力最大。 1960 年， 和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的緩沖體系應具有以下特性： ① pKa 值在 6～ 8 之間； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 鹽效應??；⑤ 離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響?。虎? 不與金屬離子生成復合物或沉淀； ⑦ 該緩沖劑化學穩(wěn)定；⑧ 紫外和可見光波長范圍內光吸收??；⑨ 易制得高純度的鹽。 生物化學常用緩沖液 ⑴ 磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個 pKa 值，所以用它們配制的緩沖液， pH 范圍最寬： NaH2PO4： pKa1＝ ， pKa2＝ Na2HPO4： pKa1＝ ， pKa2＝ 配酸性緩沖液： 用 NaH2PO4， pH＝ 1～ 4， 配中性緩沖液： 用混合的兩種磷酸鹽， pH＝ 6～ 8， 配堿性緩沖液： 用 Na2HPO4， pH＝ 10～ 12。 磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的 pH 范圍寬；③ pH 受溫度的影響??；④緩沖液稀釋后 pH 變化小，如稀釋十倍后 pH 的變化小于 。 ⑵ Tris（三羥甲基氨基甲烷， NTris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液 Tris 緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用 Tris 緩沖液，而很少再用磷酸鹽。由于標準濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若配 1L 的 TrisHCl 緩沖液：先稱 Tris 堿溶于 950mL～ 970mL 無離子水中，邊攪拌邊滴加 4N HCl，用 pH 計測定溶液pH 值至所需的 pH 值， 然后再加水補足到 1L。 其缺點是：①緩沖液的 pH 值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍， pH 值的變化大于 ；②溫度效應大，溫度變化對緩沖液 pH 值的影響很大，即： ? pKa／℃＝－ ，例如： 4℃時緩沖液的 pH＝ ，則 37℃時的 pH＝ ，所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的 TrisHCl 緩沖液不能用于 0℃～ 4℃。 ④此緩沖液對某些 pH 電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與 Tris 溶液具有兼容性的電極。 甲酸～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強，使用后可以用減壓法除之。琥珀酸有二個 pKa 值： pKa1＝ ， pKa2＝ 。 ⑷ 硼酸鹽緩沖液 １７ 常用的有效 pH 范圍是： pH＝ ～ ，因而它是堿性范圍內最常用的緩沖液，其優(yōu)點是配制方 便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡合物，尤其是能與糖類的羥基反應生成穩(wěn)定的復合物而使緩沖液受到干擾。 此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。②試劑的價格較高。他們合成的一系列 Good’s 緩沖液可查閱有關的資料。其缺點是：①價格昂貴，②對測定蛋白質含量的雙縮脲法和 Lowry 法不適用，因為它們會使空白管的顏色加深。廣泛 pH試紙的變色范圍是 pH=1～ 1 9～ 14 等，只能粗略確定溶液的 pH 值。測定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙（不可用手拿，以免污染試紙），用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸，試紙變色后與 色階板對照，估讀出所測 pH 值。也可將試紙塊放在白色點滴板上觀察和估測。 精確測定溶液 pH 值要使用 pH 計，其精確度可達 單位，關鍵是要正確選用和校對 pH 電極。 玻璃電極對溶液中的氫離子濃度敏感，其頭部為一薄玻璃泡，內裝有 HCl，上部由銀～氯化銀電極與鉑金絲聯(lián) 結。 參比電極的功能是提供一個恒定的電位，作為測量玻璃電極薄玻璃泡內外兩側電位差的參照。參比電極電位是氯離子濃度的函數(shù)，因而電極內充以 4M KCl或飽和 KCl，以保持恒定的氯離子濃度和恒定的電極電位。 現(xiàn)在 pH 測定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復合電極，即將它們共同組裝在一根玻璃管或塑料管內，下端玻璃泡處有保護罩，使用十分方便，尤其是便于測定少量液體的 pH 值。 ⑵玻璃泡極易破碎，使用時必須極為小心。 ⑷使用時復合電極的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 單位。標準緩沖液不用 時應冷藏。若測定濃蛋白質溶液的 pH 值時，玻璃泡表面會覆蓋一層蛋白質膜，不易洗凈而干擾測定，此時可用 。若電極保存時間過長，校正數(shù)值不準時，可將電極放入 2mol/L KCl 溶液中， 40℃加熱一小時以上，進行電極活化。例如，當 Na+ 濃度為 ，可使 pH 值偏低 ～ 單位。 ⑵濃度效應： 溶液的 pH 值與溶液中緩沖離子濃度和其他鹽離子濃度有關，因為溶液 pH 值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相等。 ⑶溫度效應：有的緩沖液的 pH 值受溫度影響很大，如“ Tris”緩沖液，因而配制和使用都要在同一溫度下進行。為了保持這些條件，實驗室都應裝備空調和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應保存在干燥箱中。對于需在較高溫度下進行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。 實驗室用純水 生化實驗室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實驗用試劑不能用自來水，只能使用經(jīng)過純化的水。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。 實驗室制備無離子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型強酸性陽離子交換樹脂和聚苯乙烯季胺型強堿性陰離子交換樹脂填充的陽離子和陰離子交換柱，或是陰、陽離子交換樹脂的比例為 2∶ 1 的混合柱。雖然無離子水中陰、陽離子的含量可以很低，但用離子交換法卻不能去除水中的有機物雜質，離子交換樹脂中的低分子有機化合物亦可能溶于水，因此由無離子水的 電阻率不能看出水中有機物的污染程度，有機物的污染有可能干擾生化實驗中的某些反應，也會使水的紫外吸收增加，對于那些對紫外吸收要求十分嚴格的實驗，應選用蒸餾水而不用無離子水。如欲除去有機物，可在蒸餾水器中每升水加 1g 高錳酸鉀和 1mL 85％的磷酸，以便通過氧化除去有機物。 實驗工作中不應盲目追求水的純度，水的價格隨水質的提高而成倍地增長，因此要根據(jù)實際工作的需要，即所用水中應排除的干擾物質的類型，來選用水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。 消毒系統(tǒng) 生化實驗要進行生物培養(yǎng)和生物反應的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實驗之前，都必須對實驗中用到的、可能造成污染的材料、器械等進行消毒滅菌處理。 計量系統(tǒng) 生化實驗都要求在各種標準的定量條件下進行，因此實驗室必須配備各種標準的定量系統(tǒng)。 ⑴ 稱量系統(tǒng)：最常用的設備是各種千分之一的扭力天平、電子天平和各種萬分之一的單、雙盤天平和電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制和標準物質的稱量等。 ⑶ 酸堿度 pH 測量系統(tǒng)：最常用的是 pH 試紙和 pH 計。主要有可見分光光度計、紫外／可見分光光度計和高檔的快速掃描紫外／可見分光光度計等。常用的有普通臺式離心機、高速冷凍離心機和超速離心機等。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第 4 章。主要的層析技術有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見第 3 章。它采用激光為光源，色散性強，線性范圍廣，分辨率高，所得結果可以在電腦中進行多維的圖象處理，并打印出結果，在生化實驗室中正得到越來越廣泛的使用。 核酸自動合成儀與測序儀 用于 DNA、 RNA 的自動合成及序列測定。 PCR 儀 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶鏈式反應。 PCR 儀就是將此方法實現(xiàn)了自動化操作的一種儀器，是生化與分子生物學實驗常用和必備的設備。 ⑴放射源材料存放室：用于放射源材料的存放、保管等，應較僻靜。 ⑶放射性檢測、監(jiān)測器： 在操作同位素的地方，應配備檢測、監(jiān)測器，能自動安全報警，隨時報告并指示放射源情況。常用的有液體閃爍計數(shù)器，數(shù)字式放射自顯影分析儀，蓋革計數(shù)器和Ｘ射線放射顯影盒等。 生物培養(yǎng)設施 生物培養(yǎng)是生化實驗必不可少的設備。不同的培養(yǎng)，其對設施的要求也有所不同。 植物細胞及組織培養(yǎng)： 需要恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器、生物反應器和植物房等。 為了對所培養(yǎng)的微生物和動植物細胞進行破碎，提取所需的生物大分子，還必需有各種高效率的細胞破碎裝置。常用的導入儀有：電導入儀、基因槍、激光和超聲導入儀、原生質體融合儀等。 暗室 在生化實驗研究中，必須有一間裝備完整的暗室，能對各種照相乳膠和感光材料進行處理，如各種電泳凝膠的照相沖洗和放大，放射性自顯影的 X 射線片及其他感光底片的處理，以及進行核酸與熒光物質（溴化乙錠）結合后在紫外線照射下對電泳結果的觀察操作等。 冷室 生化實驗一般都要求在低溫下進行，由于冰浴太小，冷柜也不能進人操作，因此就需要有一間 4℃～ 10℃的冷室，工作人員可以在其中進行各種柱層析、各種電泳、生物大分子的提取和分離、硫酸銨沉淀蛋白質以及各種物質的透析等操作，并可以貯存各種生物制品和生化試劑。 ⑵微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。 ⑷超聲清洗機：用于各種器皿、移液管和自動取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣等。 ⑹冰凍干燥機：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。 ⑻旋轉蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機溶液的旋轉減壓蒸餾操作。 ⑽酶標儀：用于免疫化學實驗的酶聯(lián)免疫吸附測定。能否正確熟練地使用上述這些儀器設備，在很大程度上將決定他們實驗的成敗。在自然科學，尤其是生命科學高度發(fā)展的今天，蛋白 質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，沒有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。 與化學產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點： ⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。有的生物大分子在分離過程中還在不斷的代謝，所以生物大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標準方法是不可能的。分離純化的步驟繁多，流程又長，有的目的產(chǎn)物要經(jīng)過十幾步、幾十步的操作才能達到所需純度的要求。 ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止 其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、 pH 值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷，因而實驗結果常有很大的經(jīng)驗成份，實驗的重復性較差，個人的實驗技術水平和經(jīng)驗對實驗結果會有較大的影響。 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質。③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學性質。⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難