hplc常見(jiàn)問(wèn)題和對(duì)策-展示頁(yè)
2025-01-16 12:04本頁(yè)面
【正文】 因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。 4 參數(shù) 記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但 GC 和 HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如 C－ R3A 數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔 GC 為 2ms， HPLC 為 5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎€(gè)峰或更多。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其 pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過(guò)大，色譜柱過(guò)載造成的。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。目前 HPLC 分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進(jìn)樣那頭擰開(kāi)，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過(guò)這種活，需要一定技術(shù) ，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。如果進(jìn)樣量少，原來(lái)色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過(guò)來(lái)接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過(guò)來(lái)，一般情況下就行了。我將這種情況分為四種原因。下面根據(jù)本人幾年工作的體會(huì)，提出一些看法，向同仁指教。 判斷和處理 HPLC 分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對(duì)稱而尖銳。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過(guò)的柱子。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。 如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時(shí)間的重現(xiàn)。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的 ODS 柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。盡管過(guò)去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的 ODS 填料表面硅醇基的濃度不同。 HPLC 分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ① 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理； ② 比例閥失效，更換比例閥即可； ③ 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； ④ 溶劑中的氣泡，解決的辦 法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法； ⑤ 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可； ⑥ 梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。 ⑩ 檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。 ⑨ 流動(dòng)相流量不合適。 ⑧ 記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。 ⑦ 檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù) ⑥ 檢測(cè)器池窗污染 。調(diào)整衰減即可?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子 ③ 樣品與檢測(cè)器不匹配。 ② 存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子 ③ 可能柱超載，減少進(jìn)樣量。HPLC 色譜常見(jiàn)問(wèn)題 HPLC 進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ ？ 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 HPLC 分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？ ODS 柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不重現(xiàn)，為什么？ HPLC 柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問(wèn)為什么？ ？ PEEK（ polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什么問(wèn)題？ ？ ？ ？ ？ ？ ，還有哪些因素能引起壓力改變？ 、弱溶劑？ ？ ？ ？ ？ ？ “胖”峰和平頭峰？怎樣避免？ ？ ？ ？ ？ ？ ？ HPLC 的“無(wú)限直徑效應(yīng)”？ ？ ？ HPLC 進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？ 關(guān)于漂移問(wèn)題： ① 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 ② 流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 ③ 柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡 關(guān)于快速變化問(wèn)題 ① 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 ② 泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出。 ③ 流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合 ？ ① 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖 洗柱子，替換篩板或更換柱子。 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 ① 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 ② 樣品未從柱子中流出。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器 ④ 檢測(cè)器衰減太多。 ⑤ 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為清洗池窗。解決辦法為排氣。調(diào)整電壓范圍即可。調(diào)整流速即可。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。 ODS 柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？ 這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺（ TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。 HPLC 柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問(wèn)為什么？ 柱壓過(guò)高是 HPLC 柱用戶最常碰到的問(wèn)題。 ① 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查； ② 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗 ，若壓力下降，再檢查； ③ 將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用 10 倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。 ④ 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。但是，在對(duì)樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下，會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問(wèn)題，而對(duì)色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對(duì)于新手更是如此。 色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)
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