elisa常見問題和處理-展示頁
2025-04-02 04:51本頁面
【正文】 ELISA板子(不要使用組織培養(yǎng)板)稀釋用的PBS中不要加其它蛋白緩沖液污染制備新鮮的緩沖液每次取樣必須換吸頭。移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用確定每兩步驟間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤。高CV值(CV：coefficient of variation)，花板操作不慎或洗滌不充分按說明書洗板、加樣、顯色。使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器太多的酶結(jié)合物檢查稀釋度，必要時進行效價測定太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏沒結(jié)合的過氧化物酶仍有殘留。緩沖液污染制備新鮮的緩沖液顯色劑受光照時間較長,或污染顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出酶加量過多加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準(zhǔn)確。若使用洗板機，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。最好使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。檢測時間不當(dāng)是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。檢查孵育的時間。試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右加入試劑的體積和時間有誤確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當(dāng)?shù)?。顯色弱超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。.漏加顯色劑A或B加顯色劑后觀察一下液面高度某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。不同試劑盒或不同批號的試劑混用。. . . .問題可能原因解決方法無顏色試劑孵育的時間沒有按說明書操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素HRP使用的時間是否適當(dāng)。重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加HRP酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉標(biāo)準(zhǔn)品有問題(若在標(biāo)本孔中有信號)按說明書檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體重新確認(rèn)所選用的試劑試劑配制/使用有誤將實驗重做；嚴(yán)格按說明書操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液檢查產(chǎn)品的有效期縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)酢４_定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說明書進行復(fù)溶和稀釋。樣品用NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng)儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。高背景(本底)洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。每孔應(yīng)完全充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。實驗中孵育溫度和時間不適當(dāng)確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當(dāng)檢查稀釋度，若必要進行效價測定。封閉不完全檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì)做適當(dāng)?shù)膶φ照鷺悠贩胖脮r間過長,樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑吸頭盡可能一次性使用最好使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍色應(yīng)控制底物混合的時機并立即使用封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。緩沖液中污染金屬或HRP制備新鮮緩沖液洗板尤為重要，如上所述使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。由于操作失誤或板子質(zhì)量差(結(jié)合不均勻)造成包板不均勻。 檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板
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