實(shí)驗(yàn)二植物基因組dna的分離純化及rapd擴(kuò)增-展示頁
2025-05-27 01:52本頁面
【正文】 ④ 無水乙醇 、 70%乙醇； ⑤ TE緩沖液：內(nèi)含 10 mmol/L TrisHCl、 1 mmol/L EDTA， 四 、 操作步驟 ① 取水稻幼苗 ， 液氮研磨成粉 ， 迅速分裝于 Eppendorf 管 中 ， 加入 60℃ 水浴中預(yù)熱的 2 CTAB提取液和 20 ?l ? 巰基乙醇 ， 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻； ② 樣品于 60℃ 溫浴 45min， 每 5min將 Eppendorf管上下顛倒 混勻； ③ 加入等體積氯仿 :異戊醇 (24:1)， 輕輕顛倒混勻 ， 室溫下 放置 5min， 6000g離心 10min。 提取步驟： 破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖和脂 類分子，去除 RNA，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。 核酸純化目標(biāo)： 純化后的核酸樣品中不應(yīng)該存在對(duì)酶有抑 制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的重金屬離子；其它生物大分子物 質(zhì)如蛋白質(zhì) 、 多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度；排除 RNA 分子污染 。 為了徹底除去 DNA制品中混雜的 RNA雜質(zhì)，可用 RNA酶進(jìn)行處理。反復(fù) 使用上述方法多次處理 DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去， 得到較純的 DNA制品。③ 用苯酚處理，然后離心分層，一樣可以將 DNA 與蛋白質(zhì)分離開來。用這種方法處理時(shí)，蛋白質(zhì)停留在水相和氯仿相中間，而 DNA則溶于上層水相，用兩倍體積 95%乙醇溶液可將 DNA鈉鹽沉淀出來。 分離得到核蛋白后，還需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去。在制備核酸時(shí)，通常是用研磨破壞細(xì)胞壁和 細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。 如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術(shù)的關(guān)鍵 。 95%的真核生物 DNA 主要存在于細(xì)胞核內(nèi) ， 其它 5%為細(xì)胞器 DNA， 如線粒體 、 葉綠體等 。實(shí)驗(yàn)二 植物基因組 DNA的分離純化及 RAPD擴(kuò)增 植物基因組 DNA的分離純化 一、實(shí)驗(yàn)原理 核酸包括 DNA、 RNA兩種分子 ， 在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在 。 真核生物的染色體 DNA是雙鏈線性分子 ， 原核生物的 “ 染色體 ” 、 質(zhì)粒及真核細(xì)胞器 DNA為雙鏈環(huán)狀分子 ， 有些噬菌體 DNA有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子 。 從細(xì)胞中分離得到的 DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的 DNA， 其中還含有大量 RNA， 即核 糖核蛋白 。 鹽溶法是提取 DNA的常規(guī)技術(shù)之一。利用 DNA不溶于 于 液中分開。去除蛋白的方法有 3種：① 用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除 去變性蛋白質(zhì)。② 用 十二烷基硫酸鈉 (SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，從而使其與核酸分離，也可 從材料中直接提取出 DNA。這時(shí) DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)， 吸出上層水相，加入兩倍體積的 95%乙醇即可得到白色纖維狀 DNA沉淀。本實(shí)驗(yàn)采用 CTAB法從植物幼苗中提取基因組 DNA。另外， 生物材料中還含有大量的脂肪物質(zhì)和多糖，這些物質(zhì)在用鹽溶液分離核蛋白 和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即可被除去。 操作注意事項(xiàng)： 盡量簡(jiǎn)化操作步驟 ， 縮短提取過程減少各種 有害因素對(duì)核酸的破
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1