western-blot實驗方法步驟-展示頁
2025-05-23 00:51本頁面
【正文】 一步驟。 ? 4度， 13000rpm， 30分鐘離心。吸入 。如果靶抗原耐受相應抽提過程，也可在 SDS凝膠加樣緩沖液裂解。 ? 3 哺乳動物組織通常可以機械分散并直接溶于 SDS凝膠加樣緩沖液。 溶解方法 ? 溶解方法取決于細胞的型別和待測抗原的性質(zhì)： ? 1 表達靶蛋白的細菌一般直接用 SDS凝膠加樣緩沖液裂解。 ? 往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質(zhì)來調(diào)整提取的條件。 ? 機械破碎細胞，可釋放出蛋白酶從而使靶蛋白降解。 溶解蛋白策略 ? 1 使用劇烈的條件以確保細胞蛋白能全部裂解下來，但這可能導致免疫反應性的丟失。 ? 具有從混雜抗原中檢測出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進行連續(xù)分析，具有蛋白質(zhì)反應均一性，固相膜保存時間長等優(yōu)點。Westernblot 試驗 概論 ? 它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點，與免疫沉淀法比較，這種方法無需對靶蛋白進行同位素標記。幾乎總在變性條件下進行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。 ? 被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學和臨床醫(yī)學的研究。 ? 2 采用溫和的條件以助于保持蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，但這造成蛋白質(zhì)從細胞上的脫落效果欠佳。細胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細胞內(nèi)蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。 ? 為盡可能減少可能出現(xiàn)的問題，可設(shè)法采用多克隆抗血清或多種單克隆抗體的混合物，因為他們可與某一蛋白的多種形式起反應。 ? 2 酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細胞，然后制備提取液。 ? 4 哺乳動物細胞可用去污劑溫和裂解。 細胞準備 ? 用 PBS洗兩次細胞，加入細胞裂解液，用橡膠刮子刮下細胞，由于染色體 DNA的釋放，溶液變得很粘稠。 ? 超聲打碎染色體 DNA,直至溶液不粘為止。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質(zhì)，下層為沉淀。 ? 上清用于做 SDSPAGE，如不能立即做，可將上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf 80176。插得深不起泡沫。 ? 只要被檢測蛋白占總蛋白的 1/100000,即可被檢測。 主要試劑 ? RIPA（華舜公司） ? 苯甲基磺酰氟 PMSF（華舜公司） ? 丙烯酰胺（ Amresco公司） ? 雙丙烯酰胺（ Amresco公司） ? 麗春紅染料（華舜公司） ? Tween 20（ Amresco公司） ? 過硫酸銨（ Sigma公司） ? 四甲基乙二胺 TEMED（ Sigma公司） ? 硝酸纖維素膜（ Amersham公司） ? 考馬斯亮蘭（ Fluka公司） ? 兔抗大鼠 Glut 1多克隆抗體（ Santa Cruz公司） ? PhototopeHRP Western Blot Detection System（ Cell Signaling Technology公司） 儀器與設(shè)備 ? 低溫超速離心機（ Eppendorf公司） ? 分光光度計（ Eppendorf公司） ? Thermomixer（ Eppendorf公司） ? 電泳儀（ BioRad 公司） ? 垂直式電泳槽（ BioRad 公司） ? 硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（ BioRad 公司） 配制試劑 ? 10 電泳 Buffer 稱取 Trisbase
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