【正文】 %左右，輕相液能充分的溢流出。 打開(kāi)閥 V2 V30 及泵 P7，向分離機(jī) A102 注液。 1 關(guān)閉分離機(jī) A101 開(kāi)關(guān) 一次反萃取 操作 打開(kāi)混合罐 B102 攪拌器。 1 停止混合罐 B101 攪拌器。 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 21 打開(kāi)萃余相回收閥 V26， 調(diào)節(jié) V26 閥門(mén)開(kāi)度，控制重相液位在總液位的 80%左右，使輕相液能充分的溢流至 B102。 打開(kāi)閥 V2 V24 及泵 P6，向分離機(jī)注液。 打開(kāi)閥 V21，加破乳劑。 打開(kāi)閥 V22，加稀硫酸調(diào)節(jié) PH 值。 一次 BA 萃取 操作 打開(kāi)混合罐 B101 攪拌器 打開(kāi)閥 V19，加 BA（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的 1/4~1/3 倍。 1 待 發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾排至混合罐 B101 后，關(guān)閉閥 V1 V1泵 P5以及轉(zhuǎn)筒過(guò)濾器開(kāi)關(guān)及后閥 V18。 觀察蛋白質(zhì)濃度變化，蛋白質(zhì)濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥 V11。 觀察鎂離子濃度變化，鎂離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥 V12。 觀察鐵離子濃度變化，待鐵離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥 V13。 待加料至 5000kg 時(shí)，關(guān)閉閥 V14。也有一些抗生素工廠在無(wú)菌條件下用自動(dòng)分裝機(jī) 進(jìn)行小瓶分裝。每 1mg 相當(dāng)于 1670 青霉素單位。 效價(jià)測(cè)定 取本品適量，精密稱定，加水溶液并定量稀釋制成每 1ml 中青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 17 約含 的溶液，搖勻，精密量取 10μ l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取青霉素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。 細(xì)菌內(nèi)毒素 取樣品測(cè)定，每 100 青霉素單位中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于。 溶液的澄清度與顏色 取樣品 ，加水 5ml 使溶解，溶液應(yīng)澄清無(wú)色；如顯渾濁，與濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深。 酸堿度檢測(cè) 取本品 ，加水制成每 1ml 中含 30mg 的溶液，測(cè)定。 成品鑒定是根據(jù)藥典的要求逐項(xiàng)進(jìn)行分析，包括效價(jià)鑒定、毒性試驗(yàn)、無(wú)菌檢查、熱源質(zhì)試驗(yàn)、水分測(cè)定、水溶液酸堿度及混濁度測(cè)定、結(jié)晶顆粒的色澤及大小的測(cè)定等。顆粒太細(xì)會(huì)使過(guò)濾、洗滌困難。水分在 %以下對(duì)收率影響較小。 青霉素鈉鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性質(zhì)，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋 酸鈉乙醇溶液，并控制溫度青霉素鈉鹽就結(jié)晶析出 。 利用等電點(diǎn)結(jié)晶 當(dāng)將某一抗生素溶液的 pH 調(diào)到等電點(diǎn)時(shí)，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。 結(jié)晶 抗生素精制常用結(jié)晶法來(lái)制得高純度成品。熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過(guò)程中由于被污染后雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。 脫色和去熱原質(zhì) 脫色和去熱原質(zhì)是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。 這是青霉素生產(chǎn)的最后工序。 在一次丁酯萃取時(shí)，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。為了避免 pH 波動(dòng)，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。萃取 2－ 3 次。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。 沉淀法 是一種分離抗生素簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法，濃縮倍數(shù)高，因而也是很有效的方法。所選用的溶媒與水應(yīng)是互不相溶或僅很小部分互溶，同時(shí)所選溶媒在一定的 pH 下對(duì)于 抗生素 應(yīng)有較大的溶解度和選擇性，方能用較少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分離掉雜質(zhì)。 溶媒萃取法 這是利用 抗生素 在不同的 pH 值條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)（游離態(tài)、 堿或鹽 ） 存在時(shí)，在水 及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使 抗生素 從一種液相（如發(fā)酵濾液）轉(zhuǎn)移到另一種液相（如有機(jī)溶媒）中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。 發(fā)酵液中常見(jiàn)的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、預(yù)處理需要加入的雜質(zhì)等。 化學(xué)提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成 品。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。他們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對(duì)蛋白質(zhì)有吸附作用。 Na5P3O10 + Mg2+====MgNa3P3O1 0+ 2Na+ 加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質(zhì)。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在會(huì)產(chǎn)生乳化，使溶媒合水相分離困難。 無(wú)菌室 ： 用超凈工作臺(tái)及凈化室代替無(wú)菌室，以提高無(wú)菌程度。 發(fā)酵罐 ： 發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。 蒸汽系統(tǒng)的要求 重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動(dòng)，保證生產(chǎn)時(shí)所用的蒸汽壓力在 30～ 35 千帕以上。 提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強(qiáng)空氣 的壓縮前過(guò)濾著手。請(qǐng)到左邊的導(dǎo)航欄里選擇查看防止染菌的要點(diǎn)的內(nèi)容。 防止染菌的要點(diǎn) 染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。鐵離子對(duì)產(chǎn)黃青霉綠色孢子合成 青霉素的影響見(jiàn)下表。因此，為了延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過(guò)程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。發(fā)酵結(jié)束時(shí)呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量為 16μ l/（ mg 菌絲 h），抗生素產(chǎn)率為最高水平的 30%～ 40%；而不加硫酸銨的對(duì)照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為 7%，以后逐級(jí)下降。 補(bǔ)料控制 ： 發(fā)酵過(guò)程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及 pH 外，補(bǔ)加氮源也可提高發(fā)酵單位。 1℃左右；二級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 11 25177。 溫度控制 ： 青霉菌生長(zhǎng)的適宜溫度為 30℃，而分泌青霉素的適宜溫度是 20℃左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。 pH 控制 ： 在青霉素發(fā)酵過(guò)程中， pH 是通過(guò)下列手段控制的：如 pH過(guò)高，則添加糖、硫酸或無(wú)機(jī)氮源；若 pH 過(guò)低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。培 養(yǎng)基成分對(duì)前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)前體的氧化量少。年幼的菌絲不氧化前體，而僅利用它來(lái)構(gòu)成青霉素分子。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在 %為宜。堿性時(shí)，苯乙酰胺有毒；酸性時(shí)，苯乙酸毒性較大；中性時(shí)，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。 前體究竟通過(guò)哪個(gè)途徑被菌體利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G 的側(cè)鏈前體。 發(fā)酵的過(guò)程控制 碳源控制 ： 青霉菌能利用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。發(fā)酵周期一般為 4～ 5 天，但也有少于 24 小時(shí)，或長(zhǎng)達(dá)二周以上的。發(fā)酵開(kāi)始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過(guò)滅菌，后接入種子。 在青霉素的生產(chǎn)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過(guò)濾除菌的方法。 滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶 化、消失的現(xiàn)象。采用植物油消沫仍舊是個(gè)好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑（如聚酯、聚醇類消沫劑）代替豆油。前體要在發(fā)酵開(kāi)始 20h 后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中 控制在 50181。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。因此前體的加入成為青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問(wèn)題之一。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反應(yīng)。g/ml 以上便會(huì)影響青霉素的合成。發(fā)酵時(shí)間愈長(zhǎng)，則鐵離子愈多。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。無(wú)機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。固體有機(jī)氮源原料一般需粉碎至 200 目以下的細(xì)度。主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)一定限度時(shí)，會(huì)過(guò)分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致 pH 下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)河產(chǎn)物的合成。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。 發(fā)酵培養(yǎng)基 介紹 培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。 種子 罐級(jí)數(shù)是在指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。 種子制備 種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過(guò)程 ，其 目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。 保藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無(wú)菌手續(xù)接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長(zhǎng)的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面?？股禺a(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。此法兼?zhèn)淞? 低溫、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，但過(guò)程較麻煩，需要一定的設(shè)備。在低于 15℃ 下，快速青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 7 將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后 在真空中使水分升華致干。保藏期 1～ 2 年。 甘油封藏法 向培養(yǎng)好的菌種斜面上，加入滅菌甘油，高出斜面 1cm，然后蠟封管口，放入冰箱。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。 砂土管保藏法 將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入 4～ 5℃ 冰箱中。 菌種的保藏 菌種的保藏方法有： 斜面菌種低溫保藏法 、 砂土管保藏法 、 甘油封藏法 、真空冷凍干燥法 。此外，有的青霉菌還用于生產(chǎn)灰黃霉素及磷酸二酯酶、纖維素酶等酶制劑和有機(jī)酸。 目前已發(fā)現(xiàn)幾百種，其中產(chǎn)黃青霉(Penicillum chrysogenum)、點(diǎn)青霉 (Penicillum nototum)等都能大量產(chǎn)生青霉素。 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 6 第二章 發(fā)酵工藝過(guò)程 菌種介紹 青霉是產(chǎn)生青霉素的重要菌種。氨芐青霉素耐酸廣譜；對(duì)抗綠膿桿菌的磺芐青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起過(guò)敏反應(yīng)），需要皮試。通過(guò)抑制轉(zhuǎn)肽酶，青霉素使細(xì)胞壁的合成受到抑制，細(xì)菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。青霉素作用的部位就是這個(gè)轉(zhuǎn)肽酶。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的組成是肽聚糖占細(xì)胞壁干重的 50％～80％（革蘭氏陰性菌為 1％～ 10％）、磷壁酸質(zhì)、脂蛋白、多糖 和蛋白質(zhì)。細(xì)胞壁的里面是細(xì)胞膜，膜內(nèi)裹著細(xì)胞質(zhì)。 作用機(jī)理 已有的研究認(rèn)為，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。因此青霉素的質(zhì)量單位為 : 青霉素鈉等于 1 個(gè)青霉素單位。青霉素的結(jié)構(gòu)通式可表示為 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 4 目前國(guó)際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位（ unit）；二是活性質(zhì)量（ μg），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是： 50mL 肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標(biāo)準(zhǔn)金葡萄菌生長(zhǎng)的青霉素量為一個(gè)青霉素單位。工業(yè)上應(yīng)用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。 青霉素是 6－氨基青霉烷酸（ 6aminopenicillanic acid, 6APA）苯乙酰衍生物。 1940 年，英國(guó) Florey 和 Chain 進(jìn)一步研究此菌，并從培 養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。 青霉素 生產(chǎn)仿真 使用手冊(cè) 北京東方仿真軟件技術(shù)有限公司 2020 年 8 月 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊(cè) 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)安外小關(guān)東里 10 號(hào)院，潤(rùn)宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64