【正文】 紅細(xì)胞表面帶有的A或B種凝集原．可將血型分為A、B、AB和O型4種。,為保證輸血的安全，供血者和受血者均需檢驗血型并做血交叉反應(yīng)。此時檢測(jiǎn c232。,第四十六頁，共七十三頁。 B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠獲得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其 IgG 在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細(xì)胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。b232。,第四十五頁，共七十三頁。接種次數(shù)37次，每次間隔34d，末次注射后68d取血樣測效價，達(dá)到要求，即可采血，離心分離血清。 b、免疫動物和制備抗體血清：抗原稀釋后免疫動物：家兔、馬、羊、豚鼠。,血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 （1）鑒定病原菌用的抗體試劑 A、常用診斷血清的品種和用途 B、診斷血清的制備步驟 a、制備細(xì)菌抗原：細(xì)菌接種培養(yǎng)(p233。 習(xí)慣上體外試驗用的稱試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診斷用的稱藥物。 免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑。)抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學(xué)診斷和血型測定，稱為血清學(xué)鑒定。在體外，由于(y243。,一、抗體診斷試劑 抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈顯某種反應(yīng)。ngtǐ)藥物,一、抗體(k224。,第四十一頁，共七十三頁。 4．轉(zhuǎn)基因動物表達(dá) 即將人的Ig基因組轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，讓動物產(chǎn)生人源化抗體。 3．轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 抗體基因能轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)，這方面研究較多且潛力較大的是煙草葉中的表達(dá)．表達(dá)的抗體稱為植物抗體。,2．真核細(xì)胞表達(dá) 用于表達(dá)基因工程抗體的真核細(xì)胞有酵母、昆蟲細(xì)胞、中國倉鼠卵細(xì)胞和真菌等，而且(233。)密碼子；UGA叫蛋白石密碼子。,第三十九頁，共七十三頁。融合表達(dá)有利于對抗體文庫進行淘篩，且有利于對克隆和抗體活性進行鑒定。,三、基因工程抗體的表達(dá) 在篩選(shāixuǎn)出陽性克隆后，按其目的不同，可選用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和動物等不同表達(dá)方式進行表達(dá)。 可獲得高親和力的人源化抗體：在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。 避開(b236。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。,二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點 模擬天然全套抗體庫：抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆。 ③免疫學(xué)檢測。,典型的印跡實驗包括三個步驟： ①蛋白質(zhì)的電泳分離 ②電泳(di224。,第三十五頁，共七十三頁。r)抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二(d236。)印跡,Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。,第三十四頁，共七十三頁。 4．表達(dá)與鑒定 目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進行可溶性表達(dá)。,3．淘篩 基本過程是，抗原固相化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助(fǔzh249。而克隆位點后的基因序列則有利于對可溶性表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和純化?？贵w蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)在載體表面，再感染后，能使目的克隆得以擴增。itǐ) 現(xiàn)在普遍使用噬菌粒載體，它具有噬菌體和質(zhì)粒的共同特點。,第三十二頁，共七十三頁?？贵w基因的組合形式多為單鏈抗體SCFV，也用連接(li225。,第三十一頁，共七十三頁。,一、噬菌體抗體(k224。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。)細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。,第三節(jié) 抗體工程,抗體研究的三個階段： ①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體； ②以1975年K246。是20世紀(jì)90年代發(fā)展的研究領(lǐng)域。nb225。是一種非天然性抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。 (1) Fab片段抗體：VH+CH1 (3)單鏈抗體：VHLinkerVL (2) FV抗體：VH+VL (4)單域抗體：VH或VL （5）最小識別單位（MRU）：單個CDR區(qū)構(gòu)成,第二十八頁，共七十三頁。這種改型抗體也稱CDR移植抗體 (CDR grafting antibody)。,鼠源性單克隆抗體的改造 人—鼠嵌合抗體（chimeric antibody） ：把鼠源性單克隆抗體的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)出完整的Chimeric Antibody. 改型抗體(Reshaping antibody)：用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人 Ig分子中的CDR序列，則可使人的 Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。,第二十六頁，共七十三頁。,第二十四頁，共七十三頁。)的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），生物功能則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。 原理：抗體同抗原結(jié)合(ji233。,第二十二頁，共七十三頁。鼠源性單抗在 pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5緩沖液可洗脫下 IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下 IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a， pH6.0可洗脫下IgG1。適用于IgG類。)較低。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強度下洗脫下來，其純度很高?？贵w回收率達(dá)50~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達(dá)95%以上。,（2）分離 A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。m微孔濾膜過濾，去除細(xì)菌、支原體 d.飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。nli,第二十頁，共七十三頁。,單克隆抗體的純化 根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法(fāngfǎ)。 缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。常用 基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細(xì)胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。,（2）動物體內(nèi)(tǐ n232。如在培養(yǎng)液中加入微載體，