【正文】 頁，共一百一十二頁。 5.在線監(jiān)測(jiān c232。 3.培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。ng)與展望,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程目前存在的問題： 1.細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。,4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀(xi224。 重要（有效）參數(shù)：溫度、pH、溶解氧濃度。d236。 離線測定：需要時(shí)間長，來不及指導(dǎo)控制有關(guān)參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費(fèi)用。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物(shēngw249。n)，細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性 往往是特異性的。無血清培養(yǎng)基：避免了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物(shēngw249。 在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞死亡或凋亡 主要是：營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。)和 目的蛋白的產(chǎn)量。 bel2基因的過量表達(dá)：能抑制Gln或缺氧引起的細(xì) 胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度(m236。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物(shēngw249。)攪拌和噴氣損傷）。滲透壓保護(hù)劑：甘氨酸、甜菜堿 和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護(hù)高滲對(duì)細(xì)胞生長的抑 制作用，并不影響目的蛋白的表達(dá)水平，還可使細(xì)胞長時(shí)間維 持高表達(dá)水平。nj236。,第六十四頁，共一百一十二頁。葡萄糖濃度很高時(shí)，MG升 高。對(duì)細(xì)胞有潛在損傷。應(yīng)通過控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防 止生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2的積累。bāo)代謝水平、對(duì)細(xì)胞(x236。nj236。,第六十三頁，共一百一十二頁。高濃度乳酸→抑制乳酸脫氫酶 （LDH）活性→減少乳酸產(chǎn)生→阻止NAD的再生和丙酮酸∕乳 酸轉(zhuǎn)換→NADH 增加→抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗 減少→產(chǎn)能減少→抑制生長。應(yīng)防止培養(yǎng)基中Gln自然分解和盡量去除培養(yǎng)基中的氨。zǐ)：提高細(xì)胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑 制因素的積累。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物(shēngw249。nj236。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物(shēngw249。n)：癌胚抗原（CEA）等； 單克隆抗體（MCAB）； 病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。 腫瘤特異性抗原(k224。,4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)(p233。 多肽生長因子：神經(jīng)生長因子（NGF）、成纖維 細(xì)胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血 清生長因子（SF）等。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),二、應(yīng)用：目前動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗（HbsAg）、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等； 非抗體(k224。,第五十九頁，共一百一十二頁。動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細(xì)胞全然不同。w249。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),二、應(yīng)用： 1962年以后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴(kuò)大，如今 已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方 法。,第五十八頁，共一百一十二頁。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。 20世紀(jì)70年代以來，細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器種類(zhǒngl232。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),一、生物反應(yīng)器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量 培養(yǎng)。,第五十七頁，共一百一十二頁。i)方法,5. 油浴復(fù)相乳液分離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中→水包油型小液滴 →在分散到油性物質(zhì)O中→復(fù)相油滴→溶劑N（與水混 溶但不溶解P）吸出液滴中的水分→硬化成固體小球(xiǎo qi,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。 4.銳孔噴液冷凍凝固法：成球材料溶于水溶液→銳 孔噴射成小液滴→低溫疏水性物質(zhì)中→遇冷凝固→ 含冰晶的固體小球→物理化學(xué)方法(fāngfǎ)固化成球材料→ 去除小球中的冰晶，成多孔性小球。b232。,第五十五頁，共一百一十二頁。zh236。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。 高嶺土、云母（成孔材料）、礬土、氫氧化鋁、 二氧化硅 → 碾細(xì)混勻，加甲基醋酸纖維素 → 漿液 →擠壓→球狀顆?！稍铩?000℃燒結(jié)幾小時(shí)→陶 瓷小顆?！?400 ℃ →熔化云母→多孔陶瓷載體。i)方法不同。i)方法,材料不同、制備(zh236。,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。o),分散(fēns224。itǐ)的制備,成球材料(c225。,第五十二頁，共一百一十二頁。b232。iyǎng)技術(shù),微多孔載體的制作材料：生物相容性（無毒、黏 附細(xì)胞）、機(jī)械穩(wěn)定性（保證長期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用）、熱穩(wěn)定性（高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化）要好。,第五十一頁，共一百一十二頁。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的小孔供細(xì)胞生長、增加細(xì)胞的固定化和穩(wěn)定 化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。)。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。 現(xiàn)在已開發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。分離純化細(xì)胞分泌物極其方便(fāngbi224。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞生存的立 體三維空間（類似于毛細(xì)血管）。,4.2.6.4 中空纖維(xiānw233。微囊材料：海藻酸（1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸）、多聚賴氨酸。nd224。微囊是一種人 造半透膜制成的微球體，小分子 物質(zhì)可自由穿過， 酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質(zhì)包裹在其中 不能逸出，催化反應(yīng)底物。,4.2.6.3 微囊化培養(yǎng)(p233。)穩(wěn)定性； 5. 最大的比表面積、 6.適合細(xì)胞生長的形狀和??； 7. 粒徑分布均一； 8. 能高壓滅菌；,9. 可重復(fù)利用，易于清洗； 10. 保護(hù)細(xì)胞(x236。,4.2.6.2 微載體(z224。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子（帶適當(dāng)電荷）作微載體， 利于細(xì)胞的貼壁生長。 但：勞動(dòng)強(qiáng)度大、滾瓶空間大而提供的面積有限、細(xì) 胞產(chǎn)率低、監(jiān)控不便。uz224。,4.2.6.2 微載體(z224。ngch233。,第四十五頁，共一百一十二頁。iyǎng)技術(shù),少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于懸浮生長型，離體培養(yǎng)時(shí) 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以(kěyǐ)良好 生長。,第四十四頁，共一百一十二頁。iyǎng)技術(shù),在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化 細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器和人工灌 流等技術(shù)而發(fā)展(fāzhǎn)起了動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。,第四十三頁，共一百一十二頁。)方法。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常用 的體外培養(yǎng)技術(shù)(j236。iyǎng)板培養(yǎng)(p233。,第四十二頁，共一百一十二頁。優(yōu)點(diǎn)：避免 培養(yǎng)瓶表面粗糙對(duì)培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察(guānch225。最早采用的是Carrel（1923年）設(shè)計(jì) 的卡氏瓶。iyǎng)瓶培養(yǎng)(p233。,第四十一頁，共一百一十二頁。 特點(diǎn)：液體可循環(huán)供應(yīng)。載玻片——上下 壁，金屬圈——側(cè)壁，密封成小 室，其側(cè)面有液體(y232。nzh249。,第四十頁，共一百一十二頁。 缺點(diǎn)：旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。nj236。nzhuǎn)管培養(yǎng)法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法：1933~1934年Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。iyǎng)法示意圖,第三十九頁，共一百一十二頁。ntǒng)技術(shù)（1907年Harrison創(chuàng)立）。iyǎng)法,懸滴培養(yǎng)法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上， 加一滴培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片（植塊和培養(yǎng)液懸掛）放 置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。iyǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法,第三十八頁，共一百一十二頁。ngw249。,第三十七頁，共一百一十二頁。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，開始接觸并連接成片，這 時(shí)期細(xì)胞分裂及運(yùn)動(dòng)停止。 繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞， 此時(shí)有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，無細(xì)胞分裂。 吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時(shí)間有差異。 （4）微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物,第三十六頁，共一百一十二頁。 （2）塑料：聚苯乙烯。iyǎng)。),4.2.4.1 貼壁培養(yǎng)的材料： 貼壁培養(yǎng)(p233。,4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù)(j236。 傳代技術(shù)的關(guān)鍵： 傳代時(shí)機(jī)：8090%匯合時(shí)最好（過早：細(xì)胞 產(chǎn)量不足 過晚：細(xì)胞健康不佳）。 4.2.3.2 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖(zēngzh237。 組織消化培養(yǎng) （1）取材、分離、消化 消化軟組織：0.25%胰蛋白酶 消化纖維組織：膠原酶 消化傳代細(xì)胞（制成細(xì)胞懸液）：EDTA+胰蛋白酶,第三十四頁，共一百一十二頁。ngw249。iyǎng)與傳代培養(yǎng)(p233。,第三十三頁，共一百一十二頁。u)胰酶抑制劑。 （2）促生長因子與激素： （3）酶抑制劑：如大豆(d224。如纖連蛋白（FN），層粘連蛋白（LN） 等。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。 fen)： 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)液，如HamF12和DMEM 以及許多已商品化的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，SEM用于角質(zhì)細(xì) 胞,SFM 用于淋巴細(xì)胞，等等。在基礎(chǔ)理論研究中 血清的使用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（原因與結(jié)果難以對(duì)應(yīng)）。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基： （2）無血清培養(yǎng)基（serun free medium,SFM）： 化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確培養(yǎng)基（chemical defined medium)。,第三十一頁，共一百一十二頁。低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要含：無機(jī)鹽、微 量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等。 （1）基本培養(yǎng)基（essential medium）：人工合成 的只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存（添加天然培養(yǎng)基后 細(xì)胞才能繁殖）的培養(yǎng)基。但不是完 全培養(yǎng)基，只能維持細(xì)胞不死而不能促進(jìn)細(xì)胞分裂。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基（synthetic medium）：給細(xì)胞提供近 似體內(nèi)(tǐ n232。,第三十頁，共一百一十二頁。 （4）水解乳蛋白：氨基酸含量高。n)——天然培養(yǎng)基,血清提供細(xì)胞生存、生長和增殖必須的激素與生長 因子(yīnzǐ)：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素（雌二 醇、孕酮、睪酮）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、 表皮生長因子（EGF）、血小板生長因子（PDGF） （2） 鼠尾膠原及其他膠原：細(xì)胞附著、生長的 基質(zhì)，利于組織（特別是上皮類）細(xì)胞的固定。,4.2.2 培養(yǎng)條件(ti225。成分復(fù) 雜，不同 種類、不同廠家、不同批號(hào)作用有有差異。各有特點(diǎn)。jiāng)）等。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,1. 天然培養(yǎng)基（natural medium）：來自動(dòng)物體液 或組織分離提取的培養(yǎng)基。,第二十八頁，共一百一十二頁。 氣體：容器空間中O2和CO2細(xì)胞代謝的進(jìn)行。高溫對(duì)細(xì)胞的威脅更大。oji224。)： 1. 器皿： 2. 載體：,第二十七頁，共一百一十二頁。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。 易污染、防污染：細(xì)菌、真菌、病毒；血清和 組織材料。iyǎng)的特點(diǎn),動(dòng)物細(xì)胞營養(yǎng)需求苛刻：氨基酸（細(xì)胞是不能自 主合成必須氨基酸的）、單糖（能源；合成某些氨基 酸、脂肪(zhīf225。,4.2 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的基本(jīběn)技術(shù),4.2.1 體外培養(yǎng)的特點(diǎn) 4.2.2 培養(yǎng)條件和工具 4.2.3 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)技術(shù) 4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù) 4.2.5 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法(fāngfǎ) 4.2.6 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)