【正文】 的一個重要工具。這些轉化產(chǎn)物與其在人體內代謝產(chǎn)物基本相同，其區(qū)別在于微生物轉化不能生成苯丙哌林單羥基葡萄糖苷酸結合物 (圖 112)。 ? 黃海華等利用短刺小克銀漢霉 (Cunninghamella blakesleana AS )對苯丙哌林微生物轉化進行研究。 ? 由此可見，無論從藥物代謝的氧化反應類型還是從主要代謝產(chǎn)物的種類和比例等方面對比，短刺小克銀漢霉 (Cunninghamella blakesleana AS )與人體藥 物代謝的結果都比較一致，是研究藥物 CN鍵和 CO鍵斷裂較理想的體外 模型，還可以進行相關的代謝產(chǎn)物的藥理活性實驗。在轉化液中檢測到維拉帕米 主要形成 C N鍵和 C O鍵斷裂的 10種氧化代謝產(chǎn)物，其中 N去短鏈烷基維拉帕米為主要產(chǎn)物 ，產(chǎn)率大于 65％，其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率均小于 15%。 圖 111 (一 )eburnamonine及其微生物代謝產(chǎn)物 例 2 ? 藥物 維拉帕米 在人體內代謝廣泛，主要產(chǎn)生 C N鍵和C一 0鍵斷裂的多種氧化代謝產(chǎn)物．代謝過程主要涉及CYP3A CYPlA2和 CYP2C8等酶系。 ? Adachi等利用卷枝毛霉 (Mucor circinelloides f. griseocyanus IFO 4563)和呈紫色鏈霉菌 (Striptomyces violens IFO 13486)對底物進行微生物轉化。 ? 利用微生物作為體外代謝模型研究哺乳動物代謝有以下優(yōu)點： ? ①微生物來源廣泛．種類繁多，可提供大量的篩選模型； ? ②建立微生物轉化系統(tǒng)，成本較低，操作簡單，易于控制； ? ③可以通過調節(jié)優(yōu)化條件，顯著提高代謝產(chǎn)物的收率，經(jīng)過分離純化后，可以作為代謝產(chǎn)物的對照品進行藥理和毒理研究； ? ④可以減少實驗動物用量 例 1 ? (一 )eburnamonine是一種重要的 β咔啉生物堿，臨床用于改善大腦循環(huán)和代謝。 ? 基于這一理論． Foster等研究發(fā)現(xiàn)Cunninghamella bainieri對普羅帕酮以及甲氧那明的生物轉化，與人體內的代謝過程十分類似，提示該菌具有與人體類似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用的研究。 ? Simth和 Rosazza在研究芳香化合物的微生物羥基化時，注意到微生物代謝物和哺乳動物代謝物有相似性，并于 1974年最先提出了“ 哺乳動物代謝的微生物模型 ” (microbial models of mammalian metabolism)的概念。 ? 這些方法一方面由于生物樣品常受到內源性物質的干擾，不易得到純代謝產(chǎn)物，就算得到其產(chǎn)物量也是極其少的，難以滿足結構鑒定和藥理活性篩選的需要；另一方面技術要求較高，操作復雜．井且消耗大量的實驗動物。 ? Ⅱ 相代謝反應主要是結合反 (conjugation)，包括葡萄糖醛酸結合、硫酸結合、谷胱甘肽結合等，藥物極性進一步加大，有利于排出體外。 ? Ⅰ 相代謝反應主要是官能團化 (functionalization)，包括氧化、還原、水解等反應。 ? 藥物經(jīng)代謝后通常發(fā)生結構變化，從而引起相應的藥理活性及毒性改變，例如代謝失活、代謝活化，它是直接影響藥物發(fā)揮療效的關鍵因素之一。 ? 微生物轉化規(guī)律還可以指導新藥的結構修飾，并獲得高效長效的新一代藥物，例如從硝苯地平轉化為氨氯地平， prontosil(偶氯磺胺 )發(fā)展成為磺胺藥，這些可以說明微生物轉化對新藥開發(fā)的重要性。 ? 而我國天然藥物資源比較豐富．用天然活性成分作為先導化合物尋找創(chuàng)新藥物是一個非?？扇〉耐据p． ? 余伯陽等利用 26種工業(yè)微生物對阿片類生物堿 dihydrothevinone進行微生物轉化，經(jīng)制備性實驗分離純化得到兩種主要產(chǎn)物，并鑒定為 3ODemethyldihydrothevinone和nordihydrothebinone。 ? 化學合成途往主要是化學家們依據(jù)理論、自身經(jīng)驗及文獻報道，主觀地設計合成路線，因此在仿生性和立體結構選擇性方面存在一定的難度，甚至很難實現(xiàn)； ? 相反生物體經(jīng)長期的演化進化，具有一套自身特異性的酶體系，使得生物轉化合成物質的途徑處于最佳狀態(tài)。 ? 通過微生物轉化方法合成香草醛．就是一個典型的成功例子。 ? 長期以來，人們熱衷于從天然植物中提取香料，但是由于植物資源有限，含量低，提取困難，因而價格很昂貴。） 香草醛合成 ? 香草醛 (vanillin)又稱香蘭素．是天然香料中最重要的一種。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展和應用，人們運用基因工程法構建一種新的工程菌．它能直接將葡萄糖轉化為 2酮基 L古龍酸。我國學者發(fā)明了“二步發(fā)酵法”生產(chǎn) Vc ，即在上述的乙酸桿菌轉化后，再用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobadter oxydans)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的混合菌使得 L山梨糖轉化為 2酮基 L古龍酸㈨，見圖 1— 9。 ? 最早在 l 935年， Reichstein就選用弱氧化乙酸桿菌 (A . Suboxydans)將 D一山梨醇轉化為L山梨糖，再經(jīng)多步化學反應就合成得到Vc。 維生素 C的合成 ? 維生素 C(Vc)是一種抗氧化劑，可作為食品添加劑，廣泛存在于檸檬、柑橘等水果和新鮮蔬菜中，它能用于壞血病的防治和增強機體對感染的抵抗能力，是一種輔助性治療藥物。因此它們的合成研究備受人們關注，除了傳統(tǒng)的化學合成方法外，現(xiàn)在越來越多人也重視其微生物轉化合成法。它們常具有保健、保鮮或改善風味等功能。 ? 例如黑根霉 (Rhizonpus nigricans)的羥化酶能使黃體酮 (1一 1)轉化為 11α羥基黃體酮 (12) 圖 手性甾體化合物的微生物轉化 ? 左旋多巴是 L酪氨酸的衍生物 3， 4二羥基 L苯丙氨酸，用于治療帕金森病。 ? Snell等利用細菌 Rhodococcus AJ270中的腈水合酶對消旋布洛芬酰胺進行 拆分 ，該酶對 s布洛芬酰胺的選擇性強，水解速度快，可得到 s布洛芬。 表 12三種手性化技術方法的比較 ? 微生物轉化在合成手性化合物領域已經(jīng)廣泛運用。 ? 生物合成與拆分方法 不僅不需要手性源，還能將非手性化合物轉化為手性化合物，并且克服了以上兩種方法存在的不足。 ? 當前，國際上常認為手性化技術主要有三類：色譜法、化學不對稱合成與拆分法、生物合成與拆分法。 ? 利用微生物轉化對手性化臺物的合成與拆分與化學拆分相比，有選擇性高、步驟簡單、成本低、產(chǎn)物回收率高等優(yōu)點。 ? 如用于消除孕婦早期妊娠反應的鎮(zhèn)靜劑 “反應停 ” (thalidomide，沙利度胺 )被應用不久，就被發(fā)現(xiàn)可以致使嬰兒出現(xiàn)畸形，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) 具有鎮(zhèn)靜作用的是其 R一對映體．而致畸變是由 s一對映體引起的 。 ? 盡管如此，微生物轉化已經(jīng)成為有機合成的一個重要工具 一、手性化合物合成與拆分 ? 手性是生物體的基本特征，構成生命有機體的分子大都是不對稱的手性分子。 ? 缺點 是在一些 極端的反應條件 下，如過高或過低的 pH、溫度和高鹽的濃度下，酶均易失活．微生物轉化反應就明顯暴露出其不足之處。 ? 微生物轉化應用于有機化合物的合成存在著許多優(yōu)點，同時也有一些不足之處。 ? 按照 1961年國際生化會議的規(guī)定，根據(jù)酶催化的反應類型不同，酶可以分為六大類：①氧化還原酶類；②轉移酶類； ③水解酶類；④裂合酶類；⑤異構酶類； ⑥合成酶 (連接酶 )類。 第一節(jié)在有機合成領域的應用 ? 微生物轉化技術由于其高度立體及區(qū)域選擇性在有機合成領域的應用已經(jīng)取得了顯著的效果 ,成為有機合成中的一個重要工具。 第三章 微生物轉化的應用 ? 隨著科技的迅速發(fā)展，微生物轉化得到了不斷發(fā)展，從近年來的研究可以看出， 一種微生物 可以轉化 多種 在分 子結構上完全不同 的物質； 不同種微生物 對 結構相似的物質 可以發(fā)生類似的反應。 ? 還有一個重要的規(guī)律是通常能被轉化的底物都具 有該轉化酶的誘導作用 五、生長調節(jié)劑 ? 生長調節(jié)劑 (生物激素 )對生物體代謝調節(jié)有顯著影響。 ? 在微生物轉化反應中許多重要的酶在沒有誘導的情況下是檢測不到其酶活的，這類酶稱為誘導酶。酶可以分為組成酶和誘導酶． ? 組成酶是指在微生物的生長代謝過程中會自然產(chǎn)生的一些酶， ? 而誘導酶是指在加入一定的誘導物后才會產(chǎn)生或明顯地增加產(chǎn)量的一類酶。 ? 要增加酶活力不僅要增加細胞的投入量，還要誘導細胞內酶量的增加。 ? 如在采用微生物轉化降解膽固醇的側鏈的方法制備甾體激素類藥物重要中間體雄甾二酮的過程中．通過添加含二價鐵的螯合劑來抑制開裂甾體母核的副反應。 ? 一般操作方法是先配制好表面活性荊質量濃度為 3％的轉化液，然后將不溶水的粉末狀底物滴加分散到轉化液中進行轉化，必要時可用超聲波促進分散程度。 ? 這類有機溶劑包括有低級醇 (甲醇、乙醇 )、丙酮和二甲基亞砜等； ? 但是這類水能 溶的有機溶劑超過一定量對細胞和酶都會有一定的傷害作用．每次添加的量要 盡量少 ? ③ 采用非毒性表面活性物質米分散不溶性底物 。 ? 在甾體轉化中常用此法。 ? ① 采用將底物制成細粉末狀的固體直接投料。 ? 加底物速度和量要與微生物的耐受能力相掛鉤，底物舔加的速度和總量不能超過微生物的耐受范圍， ? 同時產(chǎn)物的積累也會對酶產(chǎn)生抑制，所以必須有一個合適的底物添加量， 一般來說，非離子化合物的底物最大投料質量濃度約為 10 ％ ，而離子型的底物為 5％； 不同 的微生物對有毒性的底物的耐受性不一致，一般來說在微生物生長期其耐受有毒底物的能力比較低； 還得注意的一點是即使對沒有毒性的底物，當轉化積累到大量的非毒性底物時，也會產(chǎn)生產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，所以最好用連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵隨時分離轉化得到的產(chǎn)物。 ? 對于能溶于水的底物 來說，將其添加到水的培養(yǎng)基中進行微生物轉化是比較容易的，不過要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否對微生物有毒性。 ? 最佳溫度的選擇也可通過上述分析檢測手段來確定 二、底物添加方法 ? 在微生物轉化中，根據(jù)能否溶于水來分，可以把底物分為兩大類，即可溶于水和不可溶于水底物。 ? 不同的反應類型、不同的微生物、不同的酶，最佳反應時間不同，有的只需幾小時，有的則持續(xù)數(shù)天 ? 溫度也是影響轉化率的一個重要因素。 ? 既然是酶反