【正文】 uessmer)” 探針 猜測體 探針是根據(jù)特定物種某已知蛋白的密碼子使用頻率，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行人工合成的低簡并性寡核苷酸探針。 合成探針時(shí)必須考慮到： ①探針的 特異性 ； ②堿基的 簡并性 。 ? 堿基的簡并性可通過以下的策略來解決： ①選用簡并程度最低的序列； ②選用使用頻率最高的密碼子； ③簡并密碼子的第 3個堿基可用 H； ④應(yīng)用混合探針； ⑤控制退火溫度。 二 .cDNA的篩選 ? (1)最佳的 cDNA文庫其 mRNA在細(xì)胞中高水平特異表達(dá)； ? (2)有的目的 mRNA的豐度極低，那么就應(yīng)選擇其豐度相對較高的細(xì)胞來構(gòu)建文庫，并要計(jì)算好文庫應(yīng)具有的克隆數(shù)； ? (3)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)量常常是表明mRNA豐度的敏感指標(biāo)。 YAC維持低拷貝。 (3)酵母人工染色體 (yeast artificial chromsomes, YACs) ? 基礎(chǔ) ： 釀酒酵母中心粒、端粒和 ARS ? 導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體 ? 載體篩選：顯性篩選標(biāo)記 (營養(yǎng)缺陷型的恢復(fù) ) ? 重組篩選：插入片段大小 ? 供體 DNA大?。?2022kbp ? 主要應(yīng)用：大基因組分析， YAC轉(zhuǎn)基因小鼠 ? 評論： YAC的缺點(diǎn)是高頻率的自發(fā)缺失，和克隆的嵌合化。 H i n d I I I C o s N o t I N o t I Z T 7 S P 6 P a r C CMr H i n d I I I 部 分 酶 切 P a r B B A C o r i S P a r A P F G L r e p E H i n d I I I C I P P u l s e d f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s 連接 ? (2) P1載體和 P1人工染色體 (P1 artificial chromosomes, PACs) ? 基礎(chǔ)：噬菌體 P1 ? 導(dǎo)入宿主：體外包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo) ? 載體篩選：顯性選擇標(biāo)記 ? 重組篩選：應(yīng)用對致死標(biāo)記的打斷進(jìn)行陽性篩選 ? 供體 DNA大?。杭s 100kbp ? 主要應(yīng)用：大基因組分析 ? 評論：重排和嵌合分子少。載體 系統(tǒng) 克隆容量 評價(jià)Y A C ( 酵母人工染色體 ) 酵母著絲粒 , 復(fù)制起始點(diǎn)和端粒2 0 0 k b ～ 2 M b p 嵌合發(fā)生率高 ( 在基因組中不相連的連續(xù)片段 ) ；不穩(wěn)定 ( 自發(fā)缺失 ) ；很難與酵母染色體分離；P A C ( P 1 人工染色體 ) 細(xì)菌噬菌體 P1 100 ～ 3 0 0 k bB A C ( 細(xì)菌人工染色體 ) F 質(zhì)粒 3 0 0 k b穩(wěn)定，但在細(xì)菌外難以維持M A C s ( 哺乳類人工染色體 )基于 E p s t e i n B a r r 病毒的游離載體 3 0 0 k b 人類人工游離染色體 ( h u m a n a r t i f i c i a l e p i s o m a l c h r o m o s o m e , HAEC ) 是一類發(fā)展 中的 M A C s , 它來自于 E p s t e i n B a r r 病毒(1)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) ? 基礎(chǔ)：大腸桿菌 F質(zhì)粒 ? 導(dǎo)入宿主 ：電轉(zhuǎn)化 ? 載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：插入片段大小供體 DNA大?。?300kbp主要應(yīng)用：大基因組分析評論：低頻率的重排和嵌合分子。 ? 主要應(yīng)用：基因組文庫構(gòu)建。 二 . 粘粒 (cosmid)載體 ? 基礎(chǔ)：包含 λ 噬菌體 cos位點(diǎn)的質(zhì)粒； ? 導(dǎo)入宿主：經(jīng)體外包裝，再轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； ? 載體篩選：類似于質(zhì)粒 ? 重組篩選：可見標(biāo)記插入失活和小片段插入的陽性篩選； ? 供體 DNA大?。?3045kbp。噬菌體展示。 插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生型基因組 75105％所限制。 ? 供體 DNA的大小 ： 插入載體： 010kbp。 ? 重組篩選： 插入載體 — 通過可見標(biāo)記的插入失活 (cI基因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈；現(xiàn)代的載體攜帶 lacZ基因，以蘭 白篩選 )。 A A A A A A A m R N A ( a ) 隨機(jī)六堿基 ( b ) 寡聚 ( d T ) 引物 第一條 c D N A 的合成 A n A n N N N N N N T n ( c ) 發(fā)夾引物 ( d ) 同聚物加尾反應(yīng) 第二條 c D N A 的合成 T T T T T T G G G G G G T T T T T T C C C C C C 加接頭 1 T T T T T T G G G G G G T T T T T T A A A A A A C C C C C C A A A A A A 切除發(fā)夾 通過以下途徑將 c D N A 插入載體 a . 平端克隆 T T T T T T b . 加接頭 A A A A A A c . 進(jìn)一步進(jìn)行同聚物加尾反應(yīng) 加接頭 2 T T T T T T A A A A A A 經(jīng)酶切進(jìn)行定向克隆 c D N A 克隆 第二節(jié) 構(gòu)建文庫的載體 一 .λ 噬菌體載體 ? 基礎(chǔ)：裸露的噬菌體重組 DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。 第二鏈 cDNA的合成 是用自身引物的 ， 一個更有效的方法是在 cDNA第一鏈加尾 (如多聚胞嘧啶 )， 然后用 oligo(G)為引物起始第二鏈的合成 。然后被反轉(zhuǎn)錄 。 cDNA文庫 ? 分離代表細(xì)胞中主要 mRNA(rRNA和 tRNA因其豐富和大小的一致性 ， 可以通過分級直接分離 )。 不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究 。這可用于分離差異表達(dá)的基因。 ? (2)有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的 時(shí)空性 ，要獲得其 mRNA并非易事。 ? (5) cDNA文庫可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多種策略進(jìn)行篩選。 cDNA文庫的優(yōu)點(diǎn) ? (1)使遺傳物質(zhì)為 RNA病毒可建立文庫； ? (2)因克隆數(shù)比基因組文庫少得多，易于篩選； ? (3)從分化特異的細(xì)胞的 cDNA文庫中可分離到特異表達(dá)的基因。 )30/171l n () n (MbkbN???五 . cDNA文庫 ? 一 .概況 : ? cDNA文庫是通過反轉(zhuǎn)錄 mRNA， 并制備 雙鏈cDNA(do