【正文】 性分子流行病學研究本研究利用已有的全國HIV耐藥性調(diào)查網(wǎng)絡，隨機抽取計劃用藥者作為監(jiān)測對象，進行用藥前、用藥后每半年，一年、二年的隊列隨訪研究。以此為基礎建立快速檢測基因型耐藥的方法，采用前瞻性方法進行肺結(jié)核和骨結(jié)核病人的臨床治療對照研究，闡明其臨床應用價值，建立耐藥結(jié)核病人個體化的治療方案。最后，采用knockdown等技術手段，研究所獲得的基因（蛋白）的功能，并初步研究它們作為治療靶標的可能性。從而最終發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關蛋白與基因，闡明新的耐藥發(fā)生機制。用DNA芯片方法篩查差異基因，同時還利用蛋白質(zhì)組學方法如雙相電泳分析耐藥菌株分泌蛋白和外膜蛋白中的差異性蛋白，通過N端氨基酸測序和肽質(zhì)譜分析確定蛋白類別。（2）主要抗結(jié)核藥物耐藥基因譜的繪制及新耐藥基因與耐藥機制的研究在我國華北與華東地區(qū)耐藥菌株分子流行病學研究基礎上，進行主要耐藥基因篩查，繪制我國耐藥結(jié)核病相關基因與位點譜，為分子生物學診斷方法的研制奠定堅實基礎。同時，我們還以華東地區(qū)3個區(qū)縣所有的菌陽結(jié)核病病人（包括涂陽和涂陰病人）作為樣本，利用MIRU和IS6110－RFLP的方法鑒定所有菌株的基因型。2. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學及耐藥機制（1）我國耐藥結(jié)核病分子流行病學特征及傳播模式的研究擬對我國華北與華東地區(qū)近10年來的結(jié)核初發(fā)病人菌株庫進行DNA指紋分析，同時對這些出發(fā)病人的耐藥狀況進行鑒定，對主要抗結(jié)核藥物耐藥菌株的主要耐藥基因進行鑒定，從而對耐藥的進化特征、聚集性特征和耐藥基因分布特征進行生物信息學分析。同時可以識別主要的耐藥基因以及重要的耐藥基因組DNA片斷，以進行耐藥譜的測定，進而采用分子生物學方法直接從人體體液或相關標本中檢測細菌的特異性DNA，從而建立快速、準確的病原菌診斷方法。（3）建立耐藥菌快速基因診斷方法采用分子生物信息學技術，研究病原菌的基因組序列或特征性基因序列，種屬的保守區(qū)序列，致病基因和耐藥基因序列或特征性的基因序列等，如16SrRNA，23SrRNA，16SrRNA－23SrRNA基因區(qū)間的基因序列差異等。②耐藥機制研究：qnr產(chǎn)物Qnr蛋白對喹諾酮作用靶位DNA旋轉(zhuǎn)酶A、B亞基的保護作用、Qnr作用位點和Qnr蛋白的模建及晶體結(jié)構的研究，明確這一近年來發(fā)現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象的形成機制。 3）主動外排系統(tǒng)的研究：采用CCCP抑制試驗及外排泵調(diào)控基因PCR擴增及序列分析方法明確外排表達狀況。 1）碳青霉烯酶的研究：通過對碳青霉烯酶的篩選、酶特性及基因型分類等研究，了解產(chǎn)酶在耐藥性形成中的作用，與國外資料比較，了解國內(nèi)細菌產(chǎn)碳青霉烯酶特性；對新基因型進行基因定位（質(zhì)?；蛉旧w）、克隆表達、酶動力學等研究。目標：明確我國耐藥白色念珠菌的分子流行病學特征及耐藥變異特點；研究新的白色念珠菌耐藥相關基因及其功能，進一步闡明白色念珠菌耐藥機制；建立有效篩選抗耐藥白色念珠菌新化合物的模型。承擔單位：①上海第二醫(yī)科大學 負責人 張欣欣（教授、博士） 主要學術骨干：陸志檬（教授、博導）、龔啟明（副教授） ②南方醫(yī)科大學 主要學術骨干：溫淑娟（副教授）王戰(zhàn)會（助理研究員） ③北京大學基礎醫(yī)學院 莊輝（教授，院士），李彤（副教授） 李杰（副教授）經(jīng)費比例：13％。課題四 乙型肝炎病毒的耐藥機制主要研究內(nèi)容：核苷類似物對HBV的耐藥規(guī)律及其天然無應答性的原因、HBV變異序列特異性細胞免疫反應的研究、對導致干擾素抗病毒治療失敗的宿主因素進行分析、建立并優(yōu)化乙肝病毒表型耐藥及藥敏實驗的體外鑒定系統(tǒng)、臨床HBV耐藥監(jiān)測系統(tǒng)和網(wǎng)絡的建立。目標：系統(tǒng)地開展HIV耐藥性流行病學調(diào)查和耐藥機制的研究，為艾滋病治療提供新的抗耐藥性途徑，最終提出避免或減少HIV耐藥的出現(xiàn)和流行的新途徑。承擔單位：①復旦大學 負責人 張文宏（副教授、博士）主要學術骨干：翁心華（教授、博導）、高謙(教授、博士)楊燕萍 (講師、博士) ②中科院上海生命科學院 張穎（研究員，兼美國約翰霍普金斯大學布隆博格公共衛(wèi)生學院副教授）經(jīng)費比例：27％。課題二 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學及耐藥機制研究主要研究內(nèi)容：我國耐藥結(jié)核病分子流行病學特征及傳播模式、我國主要抗結(jié)核藥物耐藥基因譜的繪制、新耐藥基因及耐藥機制、耐藥基因型與表型的相關性以及快速基因藥敏診斷技術的臨床應用評估。承擔單位：①復旦大學 負責人 王明貴（教授、博士），主要學術骨干：張嬰元（教授、博導）、朱德妹（教授、博導）張菁（副教授、碩士）。課題一 細菌耐藥機制及其耐藥性防治研究主要研究內(nèi)容：銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制、大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥的質(zhì)粒介導耐藥機制及CTX－M型ESBL的來源及傳播機制、耐藥菌的快速診斷及預防耐藥性發(fā)生研究。人類重要傳染病病原體結(jié)核分枝桿菌細 菌真 菌乙型肝炎病毒（HBV）人類免疫缺陷病毒（HIV）（HBV）課題一 細菌耐藥機制及其耐藥性防治研究研究課題二 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學及耐藥機制課題五 白色念珠菌耐藥機制研究課題三 我國艾滋病病毒耐藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機制研究課題四 乙型肝炎病毒的耐藥機制研究病原體耐藥機制基因變異及/或新基因研究病原體分子流行病學研究抗耐藥性的新途徑研究分析重要病原體耐藥性產(chǎn)生的主要機制、影響因素，尋找抗耐藥新途徑制訂方案，有效控制重要傳染病的耐藥傳染源 制訂發(fā)247。本項目的承擔單位為國內(nèi)在病原體耐藥性研究方面具良好基礎的科研單位，其中包括數(shù)個國家或部委重點實驗室。三、研究方案總體設計思路按傳染病的常見病原體：細菌、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及真菌設置5個課題。（2）培養(yǎng)100名左右具備現(xiàn)代分子生物學知識的病原體耐藥性及耐藥機制研究的碩士、博士研究生。（4）建立高靈敏度的單一基因分子點突變檢測技術（DBSSM）測定HIV、HBV基因序列變異，提高檢測水平。（2）與國外有關單位合作建立方法，以合成肽刺激體系及Tetramer制備技術用于HBV耐藥機制的研究。（3）通過對抗耐藥性新途徑的探索性研究，可能會獲得創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)如篩選有治療意義的耐藥真菌及抗HIV的新藥靶、新藥物，為耐藥病原體的治療開辟新途徑。五年預期目標1. 理論方面：（1）通過重要傳染病病原體的分子流行病學的研究，了解我國傳染病病原體耐藥性的形成及傳播規(guī)律，如可明確耐藥結(jié)核分枝桿菌感染是否以外源性感染為主，豐富理論知識，指導耐藥性防治。4. 探索治療耐藥病原微生物的新途徑如耐藥真菌及HIV新藥及/或新藥靶的篩選等。2. 明確重要病原體包括結(jié)核分枝桿菌、細菌、HIV、HBV及白色念珠菌對主要抗感染藥物的耐藥機制、耐藥規(guī)律，以及耐藥性的形成及傳播機制。（3）抗白色念珠菌耐藥性新途徑研究利用白色念珠菌耐藥株，篩選抗耐藥白色念珠菌藥物，或與氟康唑聯(lián)合篩選，尋找氟康唑增敏劑；利用高表達含關鍵變異位點的耐藥基因（CYP5TACCAP1）的白色念珠菌，篩選抗耐藥白色念珠菌藥物或抗真菌藥物增敏劑。（2）白色念珠菌耐藥相關新基因功能及耐藥性形成機制研究研究耐藥株及其親本菌的基因組和蛋白質(zhì)組表達改變特點，發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關基因；構建新發(fā)現(xiàn)的白色念珠菌耐藥相關基因的缺失菌和高表達菌，通過考察藥物敏感性、耐藥性形成、生物膜形成、菌絲形成、藥物外轉(zhuǎn)運、靶酶活性、基因表達調(diào)控、生長周期及其他相關基因表達等表型的差異，明確新發(fā)現(xiàn)的耐藥相關基因在耐藥性形成中的作用。同時，體外藥物敏感性檢測系統(tǒng)可以為臨床醫(yī)生合理處理耐藥病毒感染提供強有力的依據(jù)。目前國內(nèi)在基因耐藥檢測技術方面發(fā)展較快，已建立基因芯片、RealTime　PCR、RFLP等方法，但在病毒藥敏檢測系統(tǒng)方面還未見報道，主要原因是該系統(tǒng)涉及技術較復雜。（4）建立并優(yōu)化乙肝病毒表型耐藥及藥敏實驗的體外鑒定系統(tǒng)國外已經(jīng)開始利用體外藥敏系統(tǒng)來協(xié)助臨床醫(yī)生選擇抗病毒藥物。（3）對導致干擾素抗病毒治療失敗的宿主因素進行分析干擾素用于慢乙肝