【正文】 變化見表2，圖2，3。10,11: Gln27Gln homozygous。6,7: Arg16Arg homozygous。2,3: Arg16Gly heterozygote。2,3為Arg16Gly型雜合子；4，5為Gln27Glu型雜合子；6，7為 Arg16Arg型純合子； 8，9為 Gly16Gly型純合子；10，11為Gln27Gln型純合子；12，13為Glu 27Glu型純合子。2. β2AR 基因 Arg16Gly、Gln27Glu 多態(tài)性的電泳結(jié)果β2AR 基因 Arg16Gly、Gln27Glu 多態(tài)性的電泳結(jié)果見圖1。以上資料統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在 軟件包中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)差表示（177。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過凝膠電泳結(jié)果判讀個(gè)體基因型，計(jì)算各組樣本基因型頻率，等位基因頻率計(jì)算采用平衡法：A=AA+1/2AC；C=CC+1/2AC。分別統(tǒng)計(jì)β2AR Arg16Gly、Gln27Glu基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶：產(chǎn)物有475bp、442bp兩種片斷，在Arg1Gly各自泳道只出現(xiàn) 475bp者分別為 Arg/Arg、Gly/Gly 基因型(Arg1Gly16 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)475bp者為Arg/ Gly基因型雜合子；在Gln2Glu各自泳道只出現(xiàn) 442bp者分別為Glu/Glu、Gln/Gln基因型(Glu2Gln27 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)442bp者為Gln/Glu基因型雜合子。：PCR反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性５min, 94℃變性45s,55℃退火50s,72℃延伸55s,共循環(huán)30周期，72℃最后一次延伸７min終止擴(kuò)增。PCR引物序列（上海生工合成）Arg16等位基因引物序列：上游5’CTTCTTGCTGGCACCCAATA 3’Gly16等位基因引物序列：上游5’CTTCTTGCTGGCACCCAATG3’Gln27等位基因引物序列：上游5’GGACCACGACGTCACGCAGC3’Glu27等位基因引物序列：上游5’GGACCACGACGTCACGCAGG3’共同下游引物為：5’ACAATCCACACCATCAGAAT3’ 使用Eppendorf梯度PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。 β2AR基因提取、擴(kuò)增 DNA的提取與鑒定：同第一部分。2 儀器和試劑主要儀器和設(shè)備及主要試劑及配制同第一部分。本研究擬通過對(duì)EH和EH+CH患者的β2腎上腺素受體Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性進(jìn)行分析，以探討β2腎上腺素受體基因多態(tài)性與EH和EH+CH的關(guān)系，為EH和EH+CH的防治提供基礎(chǔ)研究資料。EH的發(fā)病與交感神經(jīng)張力增高有著重要關(guān)系，而β2腎上腺素受體是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，它主要通過改變血管緊張性、調(diào)節(jié)腎素釋放、影響水鹽代謝等途徑調(diào)節(jié)血壓，對(duì)血壓的短期和長(zhǎng)期調(diào)節(jié)均有重要的影響。因此，ACE基因可能是其中一個(gè)微效基因，也許還與其它基因和因素影響有關(guān)，因此尚需增加EH和EH+CH的病例進(jìn)一步研究。DD基因型個(gè)體血中含有高濃度的ACE，后者可將較多的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換成血管緊張素Ⅱ，導(dǎo)致血管壁的增殖和產(chǎn)生血管病變，通過動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)皮功能障礙或斑塊潰破、血管破裂、血栓形成等諸因素相互作用，發(fā)生腦出血等腦血管病終點(diǎn)事件。DD基因型個(gè)體易發(fā)生EH和EH+CH的機(jī)制尚不清楚。但許貽白等[17]研究認(rèn)為ACE基因多態(tài)性與高血壓之間不存在相關(guān)性。近來國(guó)內(nèi)外有多個(gè)大樣本人群調(diào)查表明，EH的發(fā)病與ACE基因I/D多態(tài)性有關(guān)[1415] 。Moeda等[12]發(fā)現(xiàn)DD型ACE基因和伴腦卒中家族史的高血壓患者相關(guān)。聶瑩雪等[9]進(jìn)一步將研究對(duì)象限于原發(fā)性腦出血，并且除外了其它原因的繼發(fā)性腦出血，應(yīng)用多因素分析，降低了環(huán)境危險(xiǎn)因素對(duì)分析的干擾，發(fā)現(xiàn)ACE基因DD型對(duì)腦出血的影響更為明顯。目前有較多關(guān)于ACE基因的I/D多肽性與EH和EH+CH關(guān)系的研究，但所報(bào)道的結(jié)論不盡相同。國(guó)外研究表明，ACE基因I/D等位基因及各基因型的分布有明顯的種族和地區(qū)差異。ACE是ATⅡ生成的限速酶，Soubrier和Hubert分別于1988年和1991年成功的克隆了ACE基因，發(fā)現(xiàn)該基因定位于染色體長(zhǎng)臂17q23，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成。在RAS中，ACE可將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換成血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, ATⅡ），同時(shí)又失活緩激肽。表2 ACE I/D基因多態(tài)性基因型及I、D等位基因頻率分布(%)Tab2 Polymorphism of ACE I/D gene and frequencies of the allele (%)組別n 基因型頻率 等位基因頻率 II ID DD I D對(duì)照組6225()33()4( ) 83()42()EH7821()43()14()*85()71()*EH+CH11431()63()20()*125()103()*注：與對(duì)照組比較*P 由表2可見，與對(duì)照組比較，EH組和EH+CH組的DD基因型頻率均顯著增高，差異有顯著性（P），而II和ID基因型頻率無顯著差異，EH組和EH+CH組間的II、ID、DD基因型頻率比較亦無顯著性差異；與對(duì)照組比較，EH組和EH+CH組的D等位基因頻率均顯著增高，差異有顯著性（P），EH組和EH+CH組間的I、D等位基因頻率比較亦無顯著性差異。II型純合子個(gè)體只出現(xiàn)490bp片段，DD型純合子個(gè)體只有190bp片段，ID型雜合子個(gè)體同時(shí)具有490bp和190bp片段。 3：ID基因型；6：DD基因型；5：II基因型圖1 ACE基因I/D多態(tài)性分析Fig 1 ACE gene I/D polymorphism analysis由圖1可見，ACE基因PCR擴(kuò)增出現(xiàn)兩種DNA片段：一種是490bp的DNA片段，為I型；另一種是190bp的DNA片段，為D型。2. ACE 基因I/D多態(tài)性的電泳結(jié)果ACE 基因I/D多態(tài)性的電泳結(jié)果見圖1。注：與對(duì)照組比較，*P＜。177。177。LDLC (m mol/L)177。177。177。TC(m mol/L)177。* 177。*177。SBP(mmHg)177。177。177。s）項(xiàng)目EH（n=78）EH+CH(n=114)對(duì)照組(n=62)Age(Y)177。表1 EH組和EH+CH組的一般情況（177。以上資料統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在 。標(biāo)準(zhǔn)差表示（177。4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過凝膠電泳結(jié)果判讀個(gè)體基因型，計(jì)算各組樣本基因型頻率，等位基因頻率計(jì)算采用平衡法：A=AA+1/2AC；C=CC+1/2AC。II型純合子個(gè)體只出現(xiàn)490bp片段，DD型純合子個(gè)體只有190bp片段,ID型雜合子個(gè)體同時(shí)具有490bp和190bp片段。統(tǒng)計(jì)ACE基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶 ACE基因PCR擴(kuò)增出現(xiàn)兩種DNA片段：一種是490bp的DNA片段，為插入型（I型）；另一種是190bp的DNA片段，為缺失型（D型）。：PCR反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性5min,94℃變性45s,55℃退火50 s,72℃延伸55s,共循環(huán)30周期，72℃最后一次延伸7min終止擴(kuò)增。PCR引物序列（上海生工合成）引物1:5ˊCTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT3ˊ引物2:5ˊGAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC ACA3ˊ使用Eppendorf梯度PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增?！?。以上指標(biāo)均經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，表示單位為mmol/L。休息時(shí)坐位測(cè)量肘部血壓，脫去鞋帽只穿內(nèi)衣測(cè)量身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)（BMI）＝體重（Kg）/身高（m2）。用數(shù)滴濃 HCl或1 mmol/L HCl (室溫狀態(tài)下用PH計(jì)測(cè)定)，加ddH2O定容至100 ml轉(zhuǎn)至試劑瓶中備用。（5）STE[ mmol/L NaCl,10 mmol/L TrisHCl (PH=) 1 mmol/L EDTA (PH=)]：配制100 ml STE，需于80 ml ddH2O中加入NaCl g, 1 mmol/L TrisHCl (PH=)1 ml, mmol/L EDTA (PH=) ml,混勻后加ddH2O定容至100 ml，轉(zhuǎn)至試劑瓶中，105 Pa高壓蒸氣滅菌15min后4℃保存?zhèn)溆谩＃?）氯仿:異戊醇(V:V=24:1) 配制氯仿：異戊醇100ml，需氯仿96ml、異戊醇4ml，混勻后轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶中4℃保存。2 儀器和試劑 主要儀器和設(shè)備名稱 型號(hào) 產(chǎn)地或廠家⑴梯度PCR擴(kuò)增儀 Eppendoff AG 德國(guó)⑵ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYYIII2型 北京六一儀器廠⑶ 普通冷凍、冷藏冰箱 美菱公司⑷ 臺(tái)式高速離心機(jī) TGL16B 上海安亭科學(xué)儀器廠⑸ 臺(tái)式低速離心機(jī) 802 上海醫(yī)療器械有限公司⑹ 電熱恒溫水溫箱 江蘇太倉(cāng)市科教儀器廠⑺ 電子分析天平 JA1003 上海精科天平⑻ 凝膠圖像分析系統(tǒng) UVPGD8000 美國(guó)⑼ 紫外線透射分析儀 VCA2 北京⑽ 0754紫外分光光度儀 普析通用公司⑾ 微波爐 WP800SL23 中國(guó)順德格蘭仕電器廠⑿ 震蕩器 AC2 太倉(cāng)市科教儀器廠⒀ 瓊脂糖電泳槽 Ⅲ34A 太倉(cāng)市科教儀器廠 ⒁微量移液器 上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)公司 ⒂80℃低溫冰箱 ULT13863 日本三洋公司⒃實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng) RODI50HRE 銳思捷科學(xué)儀器有限公司⒄水平電泳槽 DYYIII型 北京六一儀器廠 主要試劑配制或來源（1）TBE配制:,硼 ,吸取 (PH=)2ml，溶解于約80 ml ddH2O中，混勻使完全溶解，加ddH2O定容至100 ml，即為5TBE溶液，上液按1:9體積加 TBE緩沖液，轉(zhuǎn)至試劑瓶中備用（2）TE(PH=) [10 mmol/L TrisHCl (PH=),1mmol/L EDTA (PH=)]配制100 ml TE,需于80 ml ddH2O中加入1mmol/L TrisHCl (PH=)1 ml,(PH=) ml。﹚歲，三大常規(guī)、生化全項(xiàng)、X線胸片、心電圖及腹部超聲等指標(biāo)均無異常。﹚歲；腦出血均為經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)，繼發(fā)性高血壓所致腦出血患者除外。并經(jīng)病史、臨床查體及實(shí)驗(yàn)室生化檢查排除繼發(fā)性高血壓。﹚歲。本研究擬對(duì)原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血患者進(jìn)行ACE基因I/D多態(tài)性分析，以探討I/D基因多態(tài)性與EH和高血壓性腦出血（essential hypertension + cerebral hemorrhage,EH+CH）的關(guān)系，為EH和EH+CH的防治提供基礎(chǔ)研究資料。第一部分 ACE基因I/D多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究原發(fā)性高血壓( essential hypertension,EH)是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。理論上，任何編碼血壓調(diào)節(jié)蛋白的基因都是原發(fā)性高血壓的候選基因，其中腎素血管緊張素系統(tǒng)和腎上腺素受體相關(guān)基因成為研究所關(guān)注的熱點(diǎn)。因高血壓是腦出血最主要的危險(xiǎn)因素，與血壓水平或高血壓相關(guān)的基因可能通過血壓和其他途徑在腦出血的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，故高血壓相關(guān)基因日漸成為腦出血的重要候選基因。尋求更好的治療方法和途徑已是迫在眉睫。高血壓性腦出血具有發(fā)病快、死亡率高、病殘率高、復(fù)發(fā)率高及恢復(fù)慢的特點(diǎn)，不管采取內(nèi)科保守治療還是外科手術(shù)治療，到目前為止治療效果總的來說還是不理想，病殘率和致殘率依然很高。③β2AR Gln27Glu多態(tài)性可能在原發(fā)性血壓和高血壓性腦出血的發(fā)病機(jī)制中不起主要作用。結(jié)論：① ACE基因DD基因型可能是原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的遺傳易感基因。⑤ Gln27Gln、%、%%；%、%%；在EH+%、%%；%%，%%，在EH+%%。 ③ Arg16Arg、%、%%，%、%%，在EH+%、%%；%%，%%，在EH+%%。結(jié)果 ① II、%、%%，%、%%，在EH+%、%%；%%，%%，在EH+%%。受試者空腹 12 小時(shí)，抽取肘靜脈血2ml,加入到2% EDTA抗凝的試管中。對(duì)照組62 例，其中男 41 例，女21 例，年齡﹙177。﹚歲，均經(jīng)頭顱CT或MRI確診。EH組78例，其中男53例，女25例，年齡﹙177。貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 2014屆碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文ACE/β2腎上腺素受體基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究目 錄符號(hào)說明………………………………………………………………1中文摘要………………………………………………………………2前 言………………………………………………………………4第一部分 ACE基因I/D多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究材料與方法…………………………………………………………5結(jié)果 ………………………………………………………………11討論 ………………………………………………………………14參考文獻(xiàn) …………………………………………………………16第二部分 β2腎上腺素受體Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關(guān)聯(lián)研究材料與方法 ………………………………………………………18結(jié)果 ………………………………………………………………20討論 ………………………………………………………………23