【正文】 試驗材料與試劑甘薯：冀9冀7冀65 由河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所提供；薯蕷皂甙元標準品（97%） 購自北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究所。3）用分光光度法測定甘薯中薯蕷皂甙元的含量具有操作簡單、快速等優(yōu)點，%%。表21 回收率試驗結(jié)果樣品號取樣量（g）樣品中薯蕷皂甙元含量（mg）加標量（mg）檢出量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD(%)123456 本章小結(jié)1）將硫酸、高氯酸、香草醛冰醋酸高氯酸這三種顯色劑進行比較，結(jié)果顯示，香草醛顯色劑以其檢測限低，穩(wěn)定性較高等優(yōu)點，適合作為甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測的顯色劑。 加樣回收率試驗取已知薯蕷皂甙元含量的甘薯樣品粉末20 g，共6份，精密稱取，加入一定量薯蕷皂甙元標準品，測其吸光度，計算其含量。%。按“”項下方法制備供試品溶液，依法顯色，于540 nm波長處測定A值，并計算含量， mg/100g干粉，%(n=6)。薯蕷皂甙元的最大吸收波長為540 nm?！?mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性相關(guān)關(guān)系，如圖25。圖24 靜置時間對分光光度檢測穩(wěn)定性的影響結(jié)果顯示，短時間內(nèi)靜置對檢測樣品的穩(wěn)定性基本上沒有影響，30 %。 靜置時間對顯色穩(wěn)定性的影響顯色反應(yīng)體系在80℃水浴加熱20 min，然后取出在冷水中冷卻，用冰醋酸定容到10 mL，在常溫常壓下靜置0、18 h，然后在540 nm下進行紫外檢測。圖23 水浴溫度對分光光度檢測穩(wěn)定性的影響，得出當水浴溫度較低，顯色體系與樣品的顯色結(jié)構(gòu)位點不能有效結(jié)合，而溫度過高會產(chǎn)生附加產(chǎn)物，使顯色加重，影響顯色體系的穩(wěn)定性。 水浴溫度對顯色穩(wěn)定性的影響反應(yīng)體系水浴時間分別為50、60、70、80、95℃，水浴20 min，其他反應(yīng)條件如上。圖22 水浴時間對分光光度檢測穩(wěn)定性影響由圖22可以看出，當水浴時間為20 min時，測得的樣品溶液中薯蕷皂甙元的含量最高。 水浴時間對顯色穩(wěn)定性的影響在80℃水浴甘薯中薯蕷皂甙元和香草醛顯色劑的反應(yīng)體系140 min，然后取出在冷水中冷卻，用冰醋酸定容到10 mL，在常溫常壓下靜置30 min，然后在540 nm下進行紫外檢測。檢測結(jié)果如圖21。因此，本實驗選用香草醛冰醋酸高氯酸顯色法。以吸光度(A)與濃度(C)求得回歸方程，繪制薯蕷皂甙元的標準曲線。 香草醛顯色劑與甘薯中薯蕷皂甙元顯色穩(wěn)定性試驗由于香草醛和甘薯中薯蕷皂甙元在顯色過程中需要進行水浴加熱和靜置等過程，而這些因素會影響顯色效果，因此分別對高氯酸用量、水浴時間、水浴溫度和樣品靜置時間進行了單因素試驗，每個試驗進行三次，取平均值，過程如下：取5 mL甘薯薯蕷皂甙元提取液于具塞試管中，水浴揮干溶劑， mL新配置的5%香草醛冰醋酸溶液和一定量高氯酸，然后進行水浴加熱，再用冰水冷卻，最后用冰醋酸將其定容至10 mL，靜置。 不同的顯色劑對分光光度檢測方法的影響本文采用硫酸、高氯酸和香草醛冰醋酸—高氯酸（以下簡稱香草醛顯色劑）三種顯色劑來檢測薯蕷皂甙元的含量。53第2章 甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測法第2章 甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測法 試驗材料與設(shè)備 試驗材料與試劑甘薯（冀9冀7冀65） 河北省農(nóng)科院糧油所薯蕷皂甙元標準品（97%） 中國藥品生物制品檢定所鹽酸，分析純天津市大茂化學試劑廠高氯酸，分析純天津市大茂化學試劑廠香草醛，分析純天津市大陸化學試劑廠氫氧化鈉，分析純天津市大陸化學試劑廠濃硫酸，分析純新光化工試劑廠氯化鉀，分析純天津市大陸化學試劑廠冰醋酸，分析純天津市大茂化學試劑廠石油醚，分析純天津大茂化學試劑廠乙腈，色譜純天津康科德科技有限公司甲醇，色譜純天津康科德科技有限公司 試驗設(shè)備1011型電熱鼓風干燥箱 天津華北試驗電爐廠玻璃儀器氣流烘干器河南豫華儀器有限公司JA 1003型電子天平( g)上海精科天平JJ 1000型電子天平( g)美國雙杰兄弟(集團)有限公司DK981型電熱恒溫水浴鍋河南省鞏義市英峪予華儀器廠SP756 p紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司DELTA 320型pH計梅特勒托利多儀器有限公司北京醫(yī)用離心機廠SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠Re201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器河南省鞏義市英峪予華儀器廠201升降恒溫水浴鍋河南省鞏義市英峪予華儀器廠SHZD(Ⅲ)型予華牌循環(huán)水式真空泵河南省鞏義市英峪予華儀器廠超聲波昆山市超聲波儀器有限公司高效液相色譜儀上海島津儀器有限公司 試驗內(nèi)容與方法 分光光度法檢測甘薯中薯蕷皂甙元方法的確定 甘薯中薯蕷皂甙元樣品的制備將甘薯清水洗凈后切片，40℃鼓風干燥24 h，冷卻后粉碎過40目篩。采用硅膠柱層析對甘薯薯蕷皂甙元的粗提液進行了純化，并用HPLC法進行了定性分析。 課題的創(chuàng)新點經(jīng)反復試驗篩選出薯蕷皂甙元含量較高的甘薯品種，并對分光光度檢測法中薯蕷皂甙元的最佳顯色劑進行了對比分析試驗，最終確定適合甘薯檢測的顯色劑和顯色條件。本課題主要針對河北省農(nóng)林科學研究院糧油所選育的新品種，進行甘薯中薯蕷皂甙元的提取工藝研究；對分光光度檢測方法中的顯色劑進行對比；并對提取方法進行優(yōu)化。本課題采用超聲波輔助法提取甘薯中的薯蕷皂甙元，選用鹽酸進行酸解預(yù)處理，目前工業(yè)上生產(chǎn)薯蕷皂甙元也多采用酸解預(yù)處理操作，此方法操作簡便，易實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，且酸解溶液中存在的大量單糖可以進行發(fā)酵，進而回收乙醇，增加企業(yè)收益。研究的內(nèi)容主要包括盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的提取，純化以及檢測等。與傳統(tǒng)方法比較提取量提高了32%。色譜條件為：色譜柱AglilengtHCC18，流動相為甲醇:水= 95:5(V:V)， mL/min，UV檢測波長為203 nm?！?10 mg/mL范圍內(nèi)，薯蕷皂甙元峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，r=。韓菊[78]等采用的提取薯蕷皂甙元的技術(shù)為超臨界CO2萃取法，原料為盾葉薯蕷，提取之后采用高效液相法進行檢測。韋建榮[77]等采用高效液相色譜法測定了重樓中薯蕷皂甙元的質(zhì)量分數(shù)。都述虎[76]等通過毛細管氣相色譜法對盾葉薯蕷中的薯蕷皂甙元含量進行檢測，樣品的峰面積在352～1758 μg范圍內(nèi)與其濃度呈良好線性關(guān)系。陶莉[75]等分別用氣相色譜法和紅外光譜法對薯蕷皂苷元進行了定性和定量。TLC法的優(yōu)點雖然比較簡單，但需要使用薄板涂層作為固定相，因此不易保存和穩(wěn)定性較差等缺點比較突出。劉玉珍[73]等通過薄層掃描對蒺藜中薯蕷皂苷進行測定，以氯仿乙酸乙酯(9:1)為展開劑，茴香醛：冰醋酸：硫酸(1:100:2)為顯色劑，λS=433 nm，λR=480 nm，結(jié)果呈良好的線性關(guān)系。試驗結(jié)果表明：方法的線形范圍為2～30 μg/mL(r=)，%；最佳顯色條件為：水浴溫度50℃、反應(yīng)時間30 min、濃硫酸用量10 mL。馬敬中[70]等用乙酸酐一濃硫酸作顯色劑對甾體化合物在460 nm進行分光光度法測定，顯色溫度為50℃，顯色劑占總體積2/5，少則色度變淺或難以顯色，多則雜質(zhì)發(fā)生干擾雖然此顯色劑對甾體皂甙元顯色具有專一性， 但由于色素的干擾，往往導致測定結(jié)果偏高。此法不需要將薯蕷皂甙元進行重結(jié)晶操作。重量法由于其原理和設(shè)備簡單，只根據(jù)薯蕷皂甙元重量即可計算其含量，因此工業(yè)生產(chǎn)常用重量法做粗略計算，但是此法誤差大逐漸被實驗室的精確檢測分析所淘汰。重量法：此法將薯蕷皂甙元的粗品烘至恒重后稱重，然后將干燥后的粗品與樣品的絕對干重的比值即為皂素含量。劉詠[67]等用硅膠層析加重結(jié)晶的方法對黃姜中薯蕷皂甙元粗品進行了提純，并對純品的結(jié)構(gòu)進行了初步鑒定，方法如下：取一定量薯蕷皂甙元粗品，以10% H2OCH3OH作溶劑溶解，將濾液加到硅膠柱上，然后用CHCl3MeOH（體積比為65:30）做沖洗劑洗柱，以TCL法帶標樣鑒別，合并相同組分，濃縮，析出晶體，離心干燥得薯蕷皂甙純品。%，%，精制度達到208%，洗脫率達到80%以上。其中對轉(zhuǎn)化效果影響最大的因素為pH、微生物接種量、培養(yǎng)溫度，最終確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件：緩沖溶液為pH ? KH2PO4緩沖液中，米曲霉接種量8%，在37℃培養(yǎng)84 h后，升溫至50℃繼續(xù)轉(zhuǎn)化8 h。 其他提取方法崔燕娟[63]等以云南重樓為原材料采用正交實驗設(shè)計方法，分別對四種提取薯蕷皂甙元的方法—直接提取法、改進酸水解法、加酶水解法、微波加熱水解法進行了工藝條件優(yōu)化，實驗結(jié)果表明：在直接提取法中，以無水甲醇為提取溶劑，薯蕷皂甙元提取率最高時的實驗條件為：樣品粒度采用20~40目、提取溫度80℃、提取時間6 h時，微波提取效果其次。李輝[62]等通過單因素和正交試驗確定了超臨界CO2提取黃姜中薯蕷皂甙元的最佳工藝條件：夾帶劑為95%的乙醇，萃取時間、壓力、萃取溫度和解析溫度分別為3 h、20 MPa、60℃、50℃；各因素對提取率影響大小為：提取時間萃取溫度萃取壓力解析溫度。魏福祥[61]等采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從穿山龍中提取薯蕷皂甙元，對提取工藝、條件進行了研究。 超臨界流體萃取法 Xiaoshun Shu[60]等通過超臨界CO2流體萃取技術(shù)從酸解后的抜葜中提取皂甙元，分別對改性劑、壓力、溫度和提取時間進行了研究。楊轉(zhuǎn)萍[59]等將超聲波與表面活性劑進行協(xié)同作用，通過單因素試驗和正交試驗考察超聲頻率、時間、料液比、表面活性劑濃度對薯蕷皂甙元提取率的影響。其操作流程為稱取黃姜粉末100 mg， mol/L濃硫酸水解4 h，然后用去離子水沖洗殘渣至中性后抽濾，濾渣干燥，加入100 mL氯仿在超聲波中提取30 min，之后用LiebemannBarcharad試劑進行顯色反應(yīng)，最后測吸光度，計算薯蕷皂甙元含量。韓楓[57]等以黃姜為原料，采用相應(yīng)面設(shè)計，對超聲波提取薯蕷皂甙元的影響因素進行了優(yōu)化，最終確定磨漿時間5 min，超聲提取時間48 min，料液比1:18(g/mL)，%，該方法與傳統(tǒng)方法相比提取率增加了19%。 超聲波法 近年來超聲波以其高效，、節(jié)能等特點在植物功能成分提取的領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。Yuqing Zhang[56]等使用聚乙二醇將纖維素酶進行改性來提高其熱穩(wěn)定性和盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的提取率。以薯蕷皂苷元的提取率為指標，優(yōu)化了該法制備薯蕷皂苷元的工藝條件，得到以下結(jié)論：酶解法比水浸提法更有利于提高皂甙元的提取率；確定料液比為1:14，纖維素酶(每克原料10 U，45℃)酶解6 h為最佳工藝條件。在水解前對原材料進行酶解是一種提高提取率的有效手段。喬振杰[54]等分別通過單因素試驗和正交試驗確定了影響盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元提取的主次因素，并通過預(yù)發(fā)酵提高了產(chǎn)率，優(yōu)化的工藝條件為原料粒徑≤1 mm，預(yù)發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵24 h，3 mol/L鹽酸水解4 h。 發(fā)酵法和酶解法的研究 Linli Qiu[53]等研究了預(yù)發(fā)酵條件對盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元提取率的影響，最終確定發(fā)酵條件為：溫度30℃、發(fā)酵3天、100 g的酵母。于武江和俞斌[51]通過二次酸水解法從黃姜中提取了薯蕷皂甙元，通過正交試驗經(jīng)過二次水解來提取薯蕷皂甙元，%，%。結(jié)果顯示優(yōu)化后的最佳條件為： g盾葉薯蕷塊莖干粉，加入25 mL、 mol/L硫酸70%異丙醇溶液， h，%。 薯蕷皂甙元的提取現(xiàn)狀 水解工藝的研究薯蕷皂甙元的生產(chǎn)工藝主要是將原料水解，脫掉糖分子鏈，提取薯蕷皂甙元粗品后進行重結(jié)晶，由于糖苷鍵的斷裂是提取過程中的工藝難點，所以水解工藝的優(yōu)化是非常必要的。薯蕷皂甙元還具有維持膽固醇正常水平和延緩衰老的功效[46～48]。此外，薯蕷皂甙元在降低血糖方面效果也比較明顯。Li[43]等研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂甙元濃度大于40 μmol/L時對MCF7乳腺癌細胞有明顯的抑制作用并呈正相關(guān)，而大于100 μmol/L變化不明顯。薯蕷皂甙元能抑制多種腫瘤細胞的侵入和繁殖以達到抗腫瘤的目的。 薯蕷皂甙元研究現(xiàn)狀 薯蕷皂甙元的功能特性近些年來，薯蕷皂甙元抗腫瘤作用被國內(nèi)外學者所重視并進行研究[38～40]。其中盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的含量最高，其次為黃山藥和穿山龍等[37]。圖11 薯蕷皂甙與薯蕷皂甙元分子結(jié)構(gòu)式薯蕷皂甙元在醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)中是一種重要的甾體中間體[35，36]。(C=，氯仿)[33]，可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等有機溶劑。楊紅花[32]等利用超聲波輔助法，對脫氫表雄酮的提純工藝進行了研究，獲得了最佳的提取條件，并通過液相檢測得到純度較高的DHEA。工業(yè)上通過合成的方法來生產(chǎn)的DHEA與天然的DHEA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)很難保證完全一樣，因此在天然植物中提取DHEA逐漸被人們所重視。脫氫表雄甾酮(dehydmepiandrostemne，DHEA)，是在人體腎上腺網(wǎng)狀區(qū)皮層中大量合成的類固醇激素，是雄激素和雌激素的中間產(chǎn)物。黃酮類化合物同樣具有清除體內(nèi)自由基抗氧化、防癌的作用[23～25]。紫甘薯中含有豐富的花色苷，長期食用紫甘薯具有潤肺、養(yǎng)顏益氣補血、降血壓等功效。Shuichi Kusano[20]等采用水提醇沉法，經(jīng)過TCA透析、柱層析和超濾的處理，在甘薯中獲得了一種新的酸性糖蛋白。劉主[18]等通過水提、醇沉，用Sevage法去除蛋白，提取出的甘薯粗多糖經(jīng)過DEAE52纖維柱洗脫純化等步驟后獲得甘薯糖蛋白純品。糖蛋白顧名思義，由多糖和蛋白質(zhì)共同組成的一種復合產(chǎn)物，作為甘薯中的一種功能性成分，它對呼吸道、消化道、漿膜腔和關(guān)節(jié)腔具有一定的的潤滑作用，保護心血管和腎臟器官結(jié)締組織，從而防止動脈硬化、腎臟萎縮并減緩人體器官的老化速度[17]。目前對甘薯多糖的提取和純化研究較多，