【正文】 （3）濾液中所含酪氨酸，即酶催化酪素產(chǎn)生的水解物是處在酸性介質(zhì)中，與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。而2號(hào)管使酶作用底物10`以后再迅速加入CCL3COOH終止反應(yīng)，故0號(hào)一開(kāi)始就有白色↓，而2管10`后加CCL3COOH后產(chǎn)生白色↓酪素。 解釋： （1）三個(gè)順列試管0為空白管，2為平行試樣管，即一樣的東西。空白管0平行管1平行管2酶液（ml）11110﹪三氯乙酸（ml）3 00酪素（ml）2 2 2 現(xiàn)象白色↓無(wú)無(wú)操作40℃水浴保溫10分鐘10﹪三氯乙酸（ml）033取9支干試管編號(hào)，按下表順序操作，所用試液均用刻度移液管準(zhǔn)確移取。 3．測(cè)定 酶催化 酪蛋白 酪氨酸基團(tuán)暴露程度不同，活力也不同。又有雜質(zhì)及不溶物混在一起，尤其是填料能吸附一部分酶體，故需研磨浸提。多次測(cè)定常采用改變稱量重量，固定稀釋倍數(shù)。而改變稀釋倍數(shù)，尤其是改變第二次稀釋倍數(shù)。 要么固定稀釋倍數(shù)改變稱量重量，以使OD落在范圍內(nèi)。（~），~。實(shí)測(cè)時(shí)只需吸取二次定容后的酶液1ml 那么實(shí)際用了所稱量酶的幾分之幾呢?(即稀釋倍數(shù)為多少呢)（10/200）（1/100）=1/2000 故稀釋倍數(shù)為2000 用了酶粉W/2000(g) 此次操作關(guān)鍵有兩點(diǎn)：稱量重量與稀釋倍數(shù)、研磨時(shí)間。如此反應(yīng)3~4次，到酶液及所有殘?jiān)D(zhuǎn)入容量瓶中，用緩沖溶液定容到200ml。測(cè)定堿性蛋白酶（如2709）或中性蛋白酶（如1398）﹪?yán)宜嘏渲? ，工業(yè)大平即可，(多點(diǎn)少點(diǎn)沒(méi)關(guān)系)于小燒杯中，在沸水浴上溶解(透明液體)，冷卻，用精密試紙檢查調(diào)節(jié)PH為測(cè)酶的最適PH,（如PH=10；PH=）然后用相應(yīng)的緩沖溶液定容到100ml，置于4℃的冰箱中保存，超過(guò)5天另外配制。 （二）測(cè)定蛋白酶活力——實(shí)測(cè) 1．底物配制 測(cè)定酸性蛋白酶（如537）﹪?yán)宜嘏渲? 加入約50mlPH=，然后在沸水中加熱，到清晰透明冷卻后再以上述緩沖溶液定容到100ml，若有泡沫，可加1～2滴無(wú)水酒精消除。儀器、試劑、比色皿厚度、操作等。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重新制作。故應(yīng)定期校正。 （2）計(jì)算求K 根據(jù)各點(diǎn)所測(cè)平均OD 分別求出K=C/OD取K=（K1+K2+K3+K4+K5）/5 （3）直接查取 （4）電腦做圖、計(jì)算、使用 四種方法均可使用，道理都一樣。各點(diǎn)OD取平均試樣的平均值，為了便于后面計(jì)算。 （3）每一個(gè)點(diǎn)均測(cè)兩份平行試樣，誤差ΔOD≤，這樣算來(lái)共用36＝18支干試管。 說(shuō)明： （1）所加各試劑均用刻度移液管移取，保證體積一至。 3．系列濃度的酪氨酸顯色并測(cè)OD值 ，福林試劑1ml，搖勻放入40℃水浴上顯色10分鐘，應(yīng)顯藍(lán)色，冷卻到室溫。（3）為什么酪氨酸用鹽酸溶解？凡有需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)，為了減少誤差，總是盡可能的使制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的條件與實(shí)際測(cè)定條件一致，消除因條件差異所帶來(lái)的誤差，提高測(cè)定準(zhǔn)確度。解釋：（1）為什么酪氨酸要干燥至恒重？在此酪氨酸作為基準(zhǔn)物，所以應(yīng)干燥至恒重，防止含有水份帶來(lái)誤差。 2．系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制取干燥試管編號(hào)按下表操作。 移取10ml上述溶液，用 。弱酸—弱酸鹽緩沖體系 PH = PKa lg（C酸/C鹽） [H2PO4] = ———— [HPO4=] Ka2 = 108 四、操作手續(xù) (一)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定光密度OD值與酪氨酸之間量的關(guān)系 1．配制100mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 分析純酪氨酸105℃烘干至恒重。 Na2HPO4 NaH2PO419g → 1000ml水溶液 B液： mol/L NaOH。 A液：2H2O→ 1000ml用時(shí)，A∶B=∶。H2O → 1000ml CH2—COOH HO—C —COOH CH2—COOHB液：。 如：測(cè)定537酸性蛋白酶選用PH= 檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液 PH=A液：。測(cè)定不同種類的酶，則選用不同體系的緩沖溶液。2．10﹪三氯醋酸 CL3CCOOH 水溶液，調(diào)節(jié)PH，終止酶促反應(yīng)；3．。HO— —CH2—CH—COOH所含的酚羥基具有還原性，可在堿性條件下將福林 ∣還原性 NH2試劑還原。雜多酸只有在酸性條件下才是穩(wěn)定的，在堿性條件下雜多酸中的配位酸根很容易被還原成各自元素的還原產(chǎn)物而呈現(xiàn)不同的顏色。用時(shí)按1∶2稀釋。2H2O 100g Na2MoO4福林試劑的制備，就是制備雜多酸的過(guò)程。一種絡(luò)合物。2CrO3而多酸中含有不相同的酸酐時(shí)稱為雜多酸。含有相同酸酐的多酸叫同多酸。 三、試劑 本次實(shí)驗(yàn)所用試劑較多，對(duì)于主要試劑重點(diǎn)掌握其配制方法和作用。然后，稱取一定量的酶制劑試樣，配成適當(dāng)濃度的溶液，以過(guò)量的酪素為底物在一定溫度、PH條件下與上述酶液作用。綜上所述，可以總結(jié)福林酚法測(cè)定蛋白酶活力的方法要點(diǎn)：用分析純的酪氨酸配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下（溫度、PH、時(shí)間）與福林試劑反應(yīng)顯色，再在分光光度計(jì)上測(cè)定光密度OD值。如：要測(cè)水解產(chǎn)生的酪氨酸的量，首先用酪氨酸配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后測(cè)定未知有色溶液的OD，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出與被測(cè)溶液濃度相對(duì)應(yīng)的C值。得到系列對(duì)應(yīng)的光密度值。那么OD與組分濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系如何確定呢?即如何確定K，即如何制作這條直線。②OD值的范圍～，因OD=，(可計(jì)算出)可通過(guò)試樣稱量，改變?nèi)芤簼舛?，或選擇不同厚度的比色皿來(lái)調(diào)節(jié)OD值的范圍。只有在最大波長(zhǎng)處，濃度較小的改變，可引起OD較大的改變，靈敏度高。因?yàn)橄舛扰c有色溶液的濃度成正比，是直線關(guān)系，而透光度T的負(fù)對(duì)數(shù)才與溶液的濃度C成正比；注意：為了保證測(cè)定準(zhǔn)確性必須：①選擇λmax有色溶液對(duì)于不同波長(zhǎng)的光選擇吸收。OD=KC組分[X] → [RX] → OD[X] OD另：OD=KCL=lg （Io/I）=－lg（Io/I）= －lgT 其中T=I/Io 叫透光度或透光率 一般分光光度計(jì)讀盤上常有OD光密度和T透光度兩種讀數(shù)OD= －lgT。 則： OD=KLC=K′C 這就是說(shuō)對(duì)于一種有色溶液的測(cè)定，選用最大吸收波長(zhǎng)，固定比色皿厚度，在一定溫度下，光密度OD與有色溶液的濃度成直線關(guān)系。 測(cè)定時(shí)，溶液性質(zhì)一定，選用此溶液最大吸收波長(zhǎng)，固定溶液的溫度，則K為一個(gè)常數(shù)，且一般都選用同樣厚度的比色皿，即液層厚度在整個(gè)測(cè)定中保持不變。其大小與有色溶液的性質(zhì)。即朗伯比爾定律。且通過(guò)實(shí)踐證明，有色溶液對(duì)光的吸收程度，也叫消光度與溶液的濃度C及液層厚度L的乘積成正比。若有色溶液的濃度C不變，液層厚度L越厚，由于增加了溶液的質(zhì)點(diǎn)，對(duì)光的吸收愈多，即光的強(qiáng)度減弱越多。那么藍(lán)色的深淺如何確定呢？通常是通過(guò)比色測(cè)其消光度來(lái)確定。而酪氨酸所含的酚羥基具有還原性，可在堿性條件下將福林試劑還原成藍(lán)色物質(zhì)。福林—酚法。 有關(guān)條件：底物濃度C 反應(yīng)溫度T 反應(yīng)PH值 反應(yīng)時(shí)間t 措施： 飽合濃度 最適溫度 最適PH 初速度時(shí)間內(nèi) 對(duì)酶而飽合的濃度 恒溫水浴 緩沖溶液 在此區(qū)間 例：537 %酪蛋白 40℃ PH= 10min 2709 %酪蛋白 40℃ PH=10 10min 1398 %酪蛋白 40℃ PH= 10min 二、測(cè)定原理 酶催化 1．酪蛋白 酪氨酸而這些酶在出廠后的長(zhǎng)途運(yùn)輸及存放過(guò)程中，由于條件的變化、振蕩、陽(yáng)光等的作用，其活力要有所改變，故在使用之前必須測(cè)定其活力，作為計(jì)算酶制劑用量的依據(jù)，以達(dá)到預(yù)期的脫毛效果。 其中酸性蛋白酶可用于毛皮的軟化。目前酶法脫毛所用的酶制劑種類也比較多。如一般出廠酶活力為5萬(wàn)單位，即：50000μg/g =。 表示為：?jiǎn)挝?g或單位/ml。酶催化底物反應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)生成物越多或消耗的反應(yīng)物量越大，則催化速度越快，活力越高。（最大活力、可比性）。 tto結(jié)論：酶催化反應(yīng)必須在反應(yīng)初速度時(shí)間內(nèi)，選擇最適溫度、最適PH，飽合底物濃度的條件下才能達(dá)到最大反應(yīng)速度，即此時(shí)酶的活力最大。（4）作用時(shí)間的影響 K=dQ/dt 直線Q（反應(yīng)物的消耗量或生成物的生成量）t↗to V恒定to↗ V ↙ to—反應(yīng)初速度時(shí)間 T最適 T（℃）每個(gè)酶都有最適溫度。 T↗T最適 速度加快。最適PH在堿性范圍內(nèi)。最適PH在中性范圍內(nèi)。最適PH在酸性范圍內(nèi)。PH最適 PH 實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)酶的最適PH值不同將酶分為酸性、中性、堿性蛋白酶。每一種酶都有其自己的最適PH值。 NH2 NH3+ ∣ ∣R—C—COOH R—C—COO ∣ ∣ H H不同的PH值都有不同的離解狀態(tài)，而不同的離解狀態(tài)又有不同的活力，而要使酶的活力最大，必需使活性基團(tuán)處在最佳理解狀態(tài)，而每一種酶要達(dá)到他的最大活力，必須處在它們最佳離解狀態(tài)。 Vmax 當(dāng)C CO　增加時(shí)，因酶活性中心已被占完再C↑，對(duì)V也無(wú)影響。 2．影響酶催化反應(yīng)的因素 （1）底物濃度 底物濃度低，酶的活性中心，沒(méi)完全和底物結(jié)合，因此隨底物濃度的增加反應(yīng)速度加快，當(dāng)C↑=C O 飽合濃度時(shí)，酶的活性中心和底物作用完全。激烈振蕩、加熱、紫外線、X射線的照射，重金屬鹽作用，會(huì)改變結(jié)構(gòu)。 由許多不同種類的氨基酸按一定順序排列構(gòu)成的多肽鏈。（3）酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。 通常被酶催化的物質(zhì)稱為該酶作用的底物。 （2）酶作用的特異性。 牛肉2～3hr可在胃腸中被酶消化。蛋白酶活力測(cè)定 一、概述 1．什么是酶？ 酶是一種生物催化劑，是由動(dòng)植物體中提取或由微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的，具有特殊催化功能的蛋白質(zhì)。思考題 1．[Fe(CN)6]標(biāo)準(zhǔn)溶液? 2．測(cè)定固體Na2S(含Na2S在50~60﹪)，一般先將其配制成一定體積一定濃度的溶液，然后再移取25ml進(jìn)行測(cè)定，[Fe(CN)6]滴定，則Na2S溶液的濃度應(yīng)為多少范圍較為合適?若配制在250ml容量瓶中，試確定Na2S試樣的稱量重量?并寫出計(jì)算公式。脫毛廢液、廢水S2的分析就不能用。適用于新脫毛液、原材料Na2S的含量分析。根據(jù)初滴數(shù)據(jù)，～1ml加入批示劑，縮短絡(luò)合物存在時(shí)間，減小穩(wěn)定性，變色敏銳，測(cè)定準(zhǔn)確。 2．為什么進(jìn)行粗滴定，再后加指示劑精滴定？ （1）在堿性介質(zhì)中S2極易被空氣中氧所氧化：2Na2S + 2O2 + H2O → Na2S2O3 + 2NaOH 造成S2的損失，影響測(cè)定結(jié)果，所以必須減少灰液與空氣接解時(shí)間，即進(jìn)行粗滴定，再滴定時(shí)可根據(jù)初滴定數(shù)值，加快滴定速度，縮短滴定時(shí)間，提高測(cè)定確度。否則PH太高S2→S 有可能繼續(xù)被氧化到SO42。 （4）堿性介質(zhì)是K3[Fe（CN）6]的安全介質(zhì)K3[Fe（CN）6] + 6H+ 3K+ + Fe3+ + 6HCN↑ (劇毒) 所以使用K3[Fe（CN）6]非但不能在一般酸性介質(zhì)中，而且還應(yīng)與酸分開(kāi)放置。在酸性介質(zhì)中 S2 + 2H+ H2S ↑[S2 ] ↓不利于反應(yīng)，且H2S有毒。 E0 S/S2 = （2）S2 + [Fe（CN）6]3+ → S ↓ + [Fe（CN）6]4+能斯特方程： [S ] E = E0 + —