【正文】 菌種保藏中心中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心在上述4個(gè)指示菌中，大腸桿菌K88的抵抗力最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌抵抗力最弱。二、菌種的復(fù)篩在芽孢桿菌的復(fù)篩過(guò)程中，設(shè)計(jì)了待篩菌與4種指示菌同步混合培養(yǎng)的方法，這種設(shè)計(jì)的目的：①創(chuàng)造豐富的營(yíng)養(yǎng)條件便于候選菌株的富集生長(zhǎng)；②采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選的芽孢桿菌營(yíng)造一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境，有利于產(chǎn)生高抗菌活性的芽孢桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)條件，拮抗其他細(xì)菌而存活下來(lái)。把上述組分均勻溶解在水溶液中，在120℃消毒30min，然后冷卻到常溫，備用。H2O:。酵母浸粉：。MNB培養(yǎng)基組成與pH：葡萄糖：。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標(biāo)芽孢桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)或者進(jìn)行攻毒試驗(yàn)幸存的動(dòng)物體中篩選。芽孢桿菌的分離篩選主要也是依據(jù)上述兩個(gè)原則。芽孢桿菌一般都不是動(dòng)物消化道內(nèi)固有菌，它們發(fā)揮作用的原因至今還沒(méi)有統(tǒng)一的定論。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)出穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的還很少。這是自然界一種自我保護(hù)的功能?？梢源罅繎?yīng)用在牛、羊等飼料中。在生長(zhǎng)羊胃液中，上述5株菌都體現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性，其存活率都在50%以上（見(jiàn)表24）表34 各種乳酸細(xì)菌在生長(zhǎng)羊胃液中的穩(wěn)定性時(shí)間/h123456格氏乳桿菌存活率/%112136羅伊氏乳桿菌存活率/%屎腸球菌存活率/%嗜酸乳桿菌存活率/%發(fā)酵乳桿菌存活率/%本組試驗(yàn)均是在羊消化道中分離獲得的乳酸菌都是天然菌，沒(méi)有經(jīng)過(guò)基因工程改造，屬于安全菌株。所以耐胃酸穩(wěn)定性也是決定乳酸菌實(shí)際使用效果的一個(gè)重要指標(biāo)，具體檢驗(yàn)方法如下：，在無(wú)菌條件下，接種到生長(zhǎng)羊、牛的胃液中，在37℃恒溫培養(yǎng)。生長(zhǎng)育肥羊的胃酸pH比較低，一般的微生物很難在其中存活，這種功能實(shí)際上也利于生羊的健康，使它可以在衛(wèi)生條件比較差的環(huán)境中生存。（圖22：乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度與吸光度值之間的關(guān)系）（圖23：乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，排除蛋白質(zhì)和葡萄糖的干擾，使測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值；優(yōu)化了顯色條件，使測(cè)定時(shí)操作簡(jiǎn)便，精確度高，顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，適合于發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定。圖21最大吸收波長(zhǎng)的確定（2） 最佳顯色條件的選擇結(jié)果表明，氫氧化鈣和濃硫酸的加入量對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著，其余因素的作用不顯著，最佳顯色條件為A2B3C2D1E1F3，即氫氧化鈣 ，20%硫酸銅 ml，濃硫酸 6 ml，對(duì)羥基聯(lián)苯 ml，靜置時(shí)間 15 min，加熱顯色時(shí)間 5 min。在565nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。，然后加入6mL濃硫酸，放置5min，冷卻至20℃以下。在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)將溶液稀釋10倍，使乳酸含量為100μg/mL。C6H4OH）溶液，儲(chǔ)存在褐色試劑瓶中。二、試 劑1. %硫酸銅溶液 將4g無(wú)水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至100ml。實(shí)驗(yàn)室乳酸含量的測(cè)定一、原 理稀乳酸在 濃硫酸作用下加熱，可以變成乙醛。乳酸在銅離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對(duì)羥基聯(lián)苯作用生成在 565 nm 處有特征吸收的紫色物質(zhì)。發(fā)酵力測(cè)定比較簡(jiǎn)單，主要測(cè)定其乳酸菌的產(chǎn)量，具體方法如下：接種分離獲得的細(xì)菌純種于試管培養(yǎng)液中，30~32℃恒溫培養(yǎng)12h，然后再擴(kuò)大接種到牛奶瓶中，30~32℃恒溫培養(yǎng)6h，測(cè)定乳酸含量。（Lactobacillus fermentium）。（Enterococcus faecium）。經(jīng)過(guò)上述分離操作，我們獲得了5株乳酸菌，它們分別是：（Lactobacillus gasseri）。如果兩天以后不出現(xiàn)理想的菌落，可以再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。在30~32℃條件下培養(yǎng)1~2d。分離純化培養(yǎng)基準(zhǔn)備好以后，就可以進(jìn)行目標(biāo)乳酸菌的分離操作了。如果培養(yǎng)基的顏色轉(zhuǎn)成粉紅就基本不合格了。為了指示培養(yǎng)基的氧化還原電位，可以在培養(yǎng)基中加入極少量的刃天青（一種顯色劑），%就足夠了。在115℃消毒殺菌30min。177。司盤(pán)80：1ml。樣品經(jīng)過(guò)預(yù)增殖培養(yǎng)以后，目標(biāo)乳酸菌含量明顯提高，可以進(jìn)入下一步分離純化操作。比較常用的是牛奶增殖培養(yǎng)液，在無(wú)抗生素牛奶中補(bǔ)充6%~8%的蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后用氮?dú)饣蛘叨趸简?qū)除溶液中殘留的空氣，再接入適量采集的樣品，在30~32℃條件下厭氧培養(yǎng)10~24h。為了提高篩選成功的幾率，在樣品進(jìn)行分離純化以前，可以對(duì)樣品進(jìn)行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標(biāo)乳酸菌的含量。最簡(jiǎn)便的方法是在溶液中加入適量的半胱氨酸，半胱氨酸有巰基（—SH），有很好的還原力，可以消除溶液中殘余的氧。我們選擇其中兩頭最健康的生羊進(jìn)行屠宰，在無(wú)菌環(huán)境中提取它的胃液、小腸液和大腸液，迅速保存在無(wú)菌生理鹽水（%）中。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)生羊進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在飼料中不斷加大大腸桿菌（,這是一種常見(jiàn)的攻毒試驗(yàn)用大腸桿菌）的用量，以檢驗(yàn)生羊的抵抗力。發(fā)生瘟疫的養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物大比例死亡，幸存的畜禽雖少，但是生命力很頑強(qiáng)，是極好的生產(chǎn)菌種采集樣本。一、 樣品的采集為了獲得合適的生產(chǎn)用乳酸菌，樣品的采集很重要。大量實(shí)驗(yàn)證明，只有動(dòng)物消化道國(guó)有的微生物才能在消化道內(nèi)定植，外源微生物只能短時(shí)間存活在消化道內(nèi)，不可能長(zhǎng)期融合到動(dòng)物消化道的微生態(tài)系統(tǒng)中。第三章 發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一節(jié) 發(fā)酵飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見(jiàn)的益生菌，生物飼料的發(fā)酵生產(chǎn)一般都離不開(kāi)乳酸菌。 研制的特定微生物菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。當(dāng)袋內(nèi)氣壓達(dá)到某一臨界值時(shí)，氣體通過(guò)硅膠膜排到外界。發(fā)酵原料粉碎機(jī)過(guò) 渡 倉(cāng)電 子 秤攪拌機(jī)菌種液計(jì)量和包裝機(jī)成品原料接種以后直接進(jìn)入包裝袋中，包裝袋上附加一個(gè)可以調(diào)節(jié)氣壓的硅膠膜。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酵飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可移動(dòng)式固態(tài)厭氧發(fā)酵飼料（也稱袋裝發(fā)酵飼料）生產(chǎn)技術(shù)。這種工藝雖然簡(jiǎn)單，但是受限制的因素很多，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也很難把握，實(shí)際推廣有一定困難。事實(shí)證明，如果環(huán)境溫度適宜，時(shí)間控制得當(dāng)，采用上述袋裝式土辦法發(fā)酵，也可以獲得質(zhì)量很好的微生物發(fā)酵飼料，活性乳酸菌的含量能達(dá)到108cuf/g以上。如果環(huán)境溫度低于12℃，發(fā)酵就有可能歸于失敗。有氧發(fā)酵階段：C6H12O6+6O2——→6CO2+6H2O無(wú)氧發(fā)酵階段：C6H12O6 ——→2CO2+2C2H5OH(乙醇)在夏季，發(fā)酵3~5d就有明顯的酸香味。然后，酵母菌在無(wú)氧條件下進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生酒精和CO2，乳酸菌也同時(shí)增殖、代謝，產(chǎn)生有機(jī)酸。適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的發(fā)酵袋是一種普通的密封包裝袋，物料接種以后裝袋，再將袋口用繩扎緊，物料的含水量為30%~40%。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酵生物飼料的成功例子主要有兩種：一種是適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的袋裝發(fā)酵飼料；另一種是屬于規(guī)模化流水線生產(chǎn)的袋裝發(fā)酵飼料。第四節(jié) 發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝一、 固態(tài)厭氧發(fā)酵高活性生物飼料相對(duì)于好氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵的能耗低，微生物代謝產(chǎn)生的熱量也要小得多，生產(chǎn)過(guò)程往往不需要翻拌散熱。這種現(xiàn)象在飼料發(fā)酵過(guò)程中可能存在，目前在研究中還沒(méi)有遇到。研究發(fā)現(xiàn)拮抗還具有明顯選擇性，農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心分離獲得的枯草芽孢桿菌MA139能分泌殺滅大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽（細(xì)菌素），但對(duì)自身、酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)代謝基本沒(méi)有影響，這種拮抗的選擇性是發(fā)酵飼料研究所希望的。如：青貯飼料接種的乳酸菌和醋酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，不斷降低pH值，結(jié)果絕大多數(shù)不耐酸的微生物不能生存，甚至趨向死亡。從理論上分析，通過(guò)控制調(diào)節(jié)微生物生存環(huán)境可以調(diào)整物料中微生物的種類和數(shù)量分布，從而達(dá)到利用微生物有益菌群種群優(yōu)勢(shì)發(fā)酵飼料的目的，但是到目前為止，有關(guān)方面的成熟技術(shù)還是很少。但是，由于生產(chǎn)成本的限制，發(fā)酵飼料的生產(chǎn)往往不能采用純種培養(yǎng)，所以微生物之間的生存競(jìng)爭(zhēng)不可避免。野生菌的代謝活動(dòng)是很“經(jīng)濟(jì)的”。目前工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)之所以采用純種培養(yǎng)，其主要原因就是消除其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)。在一個(gè)生存環(huán)境內(nèi)，不同的時(shí)間會(huì)出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)種。五、 競(jìng) 爭(zhēng)當(dāng)兩種微生物對(duì)某種環(huán)境因子有相同要求時(shí)，就會(huì)發(fā)生生存競(jìng)爭(zhēng)。真菌可以從藍(lán)藻獲得碳水化合物，真菌菌絲所攝取的水和無(wú)機(jī)鹽又可以提供給藍(lán)藻，因此地衣能耐干旱、潮濕和抗寒冷。藍(lán)藻或藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞僅限于特定的層內(nèi)，地衣內(nèi)的菌絲交織成菌絲組織，形成一個(gè)稠密的外皮層。四、 共 生共生是指兩種微生物在同一個(gè)嚴(yán)酷環(huán)境中彼此相依為命。但是把它們組合在一起，卻可以共同在沒(méi)有苯丙氨酸也沒(méi)有葉酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈兡芟嗷閷?duì)方提供必需的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。阿拉伯糖乳桿菌不能合成苯丙氨酸，糞鏈球菌不能合成葉酸。這種現(xiàn)象在發(fā)酵飼料到生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常遇到，也是利用微生物組合發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵飼料的重要理論基礎(chǔ)。還有一種比較特殊的同住微生物，好氣性菌可消耗氧氣，降低環(huán)境的氧化還原電位，使之適合于厭氧微生物的生長(zhǎng)。當(dāng)糖被酵母菌消耗以后，糖濃度的降低就有利于不耐受高滲透壓的微生物（如乳酸菌）的生長(zhǎng)。常見(jiàn)的現(xiàn)象是一種微生物產(chǎn)生一種代謝物供另一種微生物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)