【正文】 糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單 ， 電泳速度快 ， 染色 、 脫色程序簡(jiǎn)單快速； ： (1)電內(nèi)滲 (electroendosmosis， 簡(jiǎn)稱 EEO)： 是瓊脂糖電泳中由多糖骨架上的帶電基團(tuán)引起 ， 主要是硫酸酯和丙酮酸鹽 ， 這些陰離子基團(tuán)被固定在介質(zhì)中 ， 相應(yīng)的陽離子與其結(jié)合水一起向陰極移動(dòng) （ 圖 36） ， 電內(nèi)滲對(duì) DNA的分離沒有顯著影響 ， 但高電內(nèi)滲時(shí)對(duì)大分子的遷移有一定阻礙作用 ， 電泳耗時(shí)較長(zhǎng) 。 這種大孔特性有利于免疫固定 、 免疫電泳和微量制備 。 瓊脂糖的分子結(jié)構(gòu)大部分是由 1,3連接的 ?D吡喃半乳糖和 1,4連接的 3,6脫水 ?D吡喃半乳糖交替而成 。 表 32 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范圍 (kD) 適用的凝膠濃度（ T%） ＜ 10 20—30 10—40 15—20 40—100 10—15 100—500 5—10 ＞ 500 2—5 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖 (agarose)是從瓊脂中精制出來的膠狀多糖 (gelforming polysaccharide)， 瓊脂又是從天然的紅色的墨角藻(redseaweed)中提取出來的 。 大多數(shù)蛋白質(zhì)在 %凝膠中能得到滿意的結(jié)果 ，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠 。凝膠濃度不同 ， 平均孔徑也不同 ， 不同大小和形狀的大分子通過孔徑時(shí)所受的阻滯力也不同 ， 加上大分子的電荷效應(yīng) ， 使各種大分子遷移率不同得以分離 。 (3)凝膠總濃度與凝膠的分子篩效應(yīng)： 凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng) ， 在凝膠中生物大分子的分離取決于它的凈電荷和分子大小 。 凝膠孔徑大小也受凝膠總濃度的影響 ， 一般凝膠總濃度越高 ， 凝膠孔徑越小 。 當(dāng)凝膠總濃度小于 %時(shí) ， 可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量為 106以上的大分子 ， 但此時(shí)凝膠幾乎是液體 ， 通常要加 %的瓊脂糖來增加凝膠的硬度而不影響凝膠的孔徑大小； 當(dāng)凝膠濃度大于 30%時(shí) ， 則可以篩分相對(duì)分子質(zhì)量小于 2kD的多肽 , 在凝膠總濃度一定時(shí) ， 交聯(lián)劑含量不同影響凝膠的孔徑 ， 交聯(lián)劑的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系見表 31： 表 31 Bis的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關(guān)系 總凝膠濃度 (%) 平均孔徑 (197。 (1) 凝膠總濃度及交聯(lián)度對(duì)孔徑的關(guān)系： 聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于凝膠的總濃度 T和交聯(lián)度 C。 凝膠 a、 b的比例是很重要的 ， 決定了凝膠的物理性狀 。n S引入兩個(gè)計(jì)算公式 ， 即凝膠總濃度 （ T） 是表示凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總百分含量 a+b T = ——— 100% m 交聯(lián)度 （ C） 是表示凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分含量 。 凝膠總濃度及交聯(lián)度與凝膠的性質(zhì)： (1) 凝膠總濃度與凝膠特性： 凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性 ， 包括其機(jī)械性能 、 彈性 、 透明度 、粘著度及孔徑大小的主要參數(shù) 。硫酸自由基的氧原子激活 Acr單體并形成單體長(zhǎng)鏈： Bis將單體長(zhǎng)鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)： 聚合反應(yīng)受各種因素的影響 ， 如系統(tǒng)中催化劑和加速劑的濃度 、 pH、 溫度 、 分子氧和雜質(zhì)都會(huì)影響凝膠的聚合過程 。175。 (1)APTMTED催化體系： 屬于化學(xué)聚合作用 ， TMTED是一種脂肪族叔胺 ， 分子式為 H3C\ /CH3 N(CH2)2N H3C/ \CH3 它的堿基可催化溶液中的 AP使其形成游離氧自由基 ， 激活 Acr單體形成單體長(zhǎng)鏈 ， 同時(shí)在交聯(lián)劑 Bis的作用下長(zhǎng)鏈彼此交聯(lián)聚合成凝膠 ， 反應(yīng)式如下： 聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基 (free radicals)的催化 ， 使體系發(fā)生氧化還原作用 (catalystredox systems)來完成的 。 (6)凝膠雜質(zhì)少 ， 在很多溶劑中不溶 ， 可適用于少量樣品的制備 ， 不致污染樣品 。 并有多種染色方法提高電泳條帶顯色的靈敏度 ， 分離蛋白質(zhì)的靈敏度可達(dá) 106g。 與生物大分子不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 電泳過程中不受溫度 、 pH的變化的影響 。 根據(jù)待分離大分子的相對(duì)分子質(zhì)量 ， 通過改變凝膠濃度及交聯(lián)劑度來調(diào)節(jié)凝膠的孔徑 ， 使大分子得到較好的分離 。 用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophorsis， 簡(jiǎn)稱 PAGE)。 淀粉凝膠由于質(zhì)量難以控制 ， 操作繁瑣 ， 分辨率低 ， 實(shí)驗(yàn)室中已很少使用 ，現(xiàn)在用得最多的是聚丙烯酰胺凝膠 、 瓊脂糖凝膠 。 這類介質(zhì)相對(duì)薄膜類又了進(jìn)一步 ， 它具有高粘度和高摩擦阻力 ， 它在電泳過程中不僅能防止對(duì)流 ， 減小擴(kuò)散 ， 還具有凝膠的多孔性 ， 孔徑與蛋白質(zhì)分子大小大致相同 ， 因而能產(chǎn)生分子篩效應(yīng) (molecular sieving effect)， 其分離作用既與電荷密度有關(guān) ， 又與分子大小有關(guān) ， 因而凝膠的分離原理是基于大分子的電荷密度和分子大小 ， 對(duì)分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的生物大分子極為有利 。 (3)分布均勻：內(nèi)電滲小 ， 結(jié)果重復(fù)性好 電泳的固體支持介質(zhì)可以分為兩類 : (1)薄膜類： 薄膜類包括紙類 ， 醋酸纖維素薄膜 ， 聚酰胺薄膜等 . 這類支持介質(zhì)化學(xué)惰性好 ， 在電泳過程中產(chǎn)生的對(duì)流和擴(kuò)散較小 ， 分離的基本原理主要是基于生物大分子的電荷密度 。 支持介質(zhì)應(yīng)當(dāng)具備以下特性： (1)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影響 ， 保持原有的狀態(tài)和性能 。 (1)凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳； (2)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳； (3)聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳； (4)聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳； (5)聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦； (6)聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移印跡電泳； (7)瓊脂糖凝膠水平電泳； (8)瓊脂糖凝膠脈沖電泳； (9)瓊脂糖凝膠免疫電泳 。 (2)搭橋電泳： 為水平式 ， 水平板狀電泳槽形式多樣 ， 凝膠和緩沖液通過間接接觸的方式 ， 如用濾紙橋搭接 ， 用緩沖液制作的凝膠條或?yàn)V紙條搭接 （ 圖 34） ， 后兩者即半干技術(shù) ， 多用于免疫電泳 、 等電聚焦 。電泳的操作模式有按操作方式和分離原理分類 。 垂板電泳槽 轉(zhuǎn)移電泳槽 平板電泳槽 雙向電泳槽 制備電泳槽 隨著電泳技術(shù)的發(fā)展 ， 電泳技術(shù)的種類逐漸增加 ， 凝膠電泳在制膠 、 電泳系統(tǒng)的冷卻 、 凝膠染色及結(jié)果分析等方面手段日趨完善 ， 科學(xué)家們研制出各種電泳附屬設(shè)備 ， 如梯度混合儀 、 外循環(huán)恒溫系統(tǒng) 、 脫色儀 、 凝膠干燥系統(tǒng) 、凝膠掃描儀 、 凝膠成像儀等 。 另外， 板膠電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量容易消散 ， 凝膠電泳結(jié)果便于照相和制成干膠 。