基因診斷genediagppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-05-04 22:02本頁(yè)面
【正文】 1000個(gè)堿基對(duì)中就有 1個(gè)， 34個(gè)相鄰的標(biāo)記構(gòu)成的單倍型（ haplotype）就可有 816種。 定義 :主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的 DNA序列多態(tài)性。該策略的前提是基因已被克隆 . ：即通過(guò)檢測(cè)與致病基因連鎖 的 遺傳標(biāo)記 進(jìn)行基因診斷 . 人類(lèi)基因組上的 DNA遺傳標(biāo)記 1980 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLPs ) 1985 短串聯(lián)重復(fù)序列 (short tendem repeats, STRs ,mini satellites ) 1990s 單核苷酸多態(tài)性 (singlenucleotide polymorphisms SNPs) 短串聯(lián)重復(fù)序列 STRs (short tendem repeats, Microsatellites ) STR廣泛存在于人基因組，占約 5%， 基本單位是 1bp8bp的 串聯(lián)重復(fù)， 重復(fù)次數(shù) n=1560，已知 8000多個(gè)， 主要形式為： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ， 其中以 (CA)n ， (GT)n 為多見(jiàn)。不可能通過(guò)前面的方法來(lái)診斷，必須利用差異顯示等技術(shù)找出正常人和疾病患者之間的差異序列，鑒定與疾病相關(guān)的多個(gè)基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷?？梢酝ㄟ^(guò)一個(gè)或幾個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的分析，了解另一個(gè)或幾個(gè)基因。 診斷方法：根據(jù)突變的基因序列設(shè)計(jì)探針 . 二 .通過(guò)連鎖遺傳標(biāo)志檢測(cè)診斷疾病 許多基因病，雖然它們的基因結(jié)構(gòu)還沒(méi)有闡明，但通過(guò)染色體分析已被定位在染色體的特定位置上，這些基因是通過(guò)檢測(cè)與特定染色體位點(diǎn)連鎖的遺傳標(biāo)記來(lái)發(fā)現(xiàn)的。 第二節(jié) 對(duì)不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略 一 .通過(guò)致病基因的檢測(cè)診斷疾病 已經(jīng)基本清楚基因突變與疾病發(fā)生之間的分子機(jī)制，相關(guān)的基因已被克隆，測(cè)序，并被定位在染色體上。 基因芯片按照用途分為：表達(dá)芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測(cè)序芯片，毒理芯片等。 DNA 測(cè)序測(cè)定是基因突變檢測(cè)的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì) （四） DNA芯片技術(shù) DNA芯片（ DNA chip)又稱(chēng)為基因芯片， DNA微陣列（ DNA microarray) 該技術(shù)的基礎(chǔ)仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預(yù)先設(shè)計(jì)好的核酸探針（ oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成 DNA微陣列?；?qū)?PCR產(chǎn)物克隆到載體上 ,抽取質(zhì)粒 ,經(jīng)過(guò)測(cè)量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量 .優(yōu)點(diǎn) :穩(wěn)定 ,準(zhǔn)確 . ② .相對(duì)定量 :指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定一內(nèi)源性管家基因 (如 β actin, rRNA等 ),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較 ,反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在 PCR擴(kuò)增的影響因素 . (三） DNA序列測(cè)序 ? 1977年 Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序列測(cè)序法 用放射性同位素標(biāo)記引物，用 雙脫氧核苷酸 隨機(jī)終止 DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的 DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結(jié)果。和非甲基化特異性引物（引物中 A結(jié)合模板中 U),通過(guò) PCR擴(kuò)增就可檢測(cè)出甲基化等位基因化學(xué)修飾的 DNA序列和非甲基化等位基因序列． 用于一些疾病和腫瘤的基因診斷． (6)采用 PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析 定量 PCR(quantiative PCR, QPCR): 就是對(duì)靶核酸分子進(jìn)行定量分析的技術(shù) .根據(jù) PCR擴(kuò)增指數(shù)增長(zhǎng)期原理，理論上擴(kuò)增產(chǎn)物累積分子數(shù) N=No(1+E),其中 E是指每次循環(huán)中參與復(fù)制的模板數(shù)與總模板數(shù)的比率 .通過(guò) N值可求出 No. 但 PCR擴(kuò)增時(shí)平臺(tái)期 (1525)的出現(xiàn)會(huì)影響測(cè)量的準(zhǔn)確度 .定量 PCR的策略和方法較多 . n a. 通過(guò)測(cè)定 PCR產(chǎn)物量 方法 : 對(duì)已知量的靶 DNA進(jìn)行系列稀釋 ,比較待測(cè)樣品和已知系列稀釋樣品的 PCR產(chǎn)量 ,還可對(duì)未知量的靶 DNA進(jìn)行絕對(duì)定量 . b. 采用極限稀釋法對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析 : 方法 :將待測(cè) DNA標(biāo)本進(jìn)行倍數(shù)稀釋 ,直至擴(kuò)增不到靶基因的稀釋度 ,用稀釋程度表示啟始靶基因分子數(shù)的相對(duì)量 ,是一種半定量方法 . 方法 :該方法是在一個(gè)試管內(nèi)同步擴(kuò)增來(lái)自同一DN
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