【正文】 PCR 大片段的缺失、和點(diǎn)突變 *兩個(gè)等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢 出兩個(gè)等位抑癌基因。 檢測(cè)方法： Southern 雜交 定量 PCR 基因的過(guò)量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過(guò)量表達(dá)及非 DNA水平的過(guò)量表達(dá)。 兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長(zhǎng)處于平衡狀態(tài)。 非典型性肺炎（ SARS） 由一種新型冠狀病毒（ SARSCoV）引起，多種 途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。 HIV特異地侵犯輔助性 T細(xì)胞（ CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會(huì)性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。 ④ 通過(guò)放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯 色分析結(jié)果 .若發(fā)現(xiàn)單鏈 DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該 DNA片段中有堿基突變 . 基因芯片 將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。（可與 PCR聯(lián)用： PCRASO） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ SSCP） 日本 Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈 DNA片段呈復(fù)雜的 空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或 多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變， 空間構(gòu)象有差異的單鏈 DNA分子在聚丙烯酰胺 凝膠中受排阻大小不同 .因此，通過(guò) 非變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)， 可以非常 敏銳地將構(gòu) 象上有差異的分子分離開(kāi) . PCRSSCP PCRSSCP基本過(guò)程 ① PCR擴(kuò)增靶 DNA ② 將特異的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速?gòu)?fù)性 。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即等位片段之間 差別只有幾個(gè) bp。為達(dá)到 選擇性 擴(kuò)增的目的，再在模板末端添加具有 選擇性核苷酸（ 1～ 3個(gè)）的不同引物 ，然后 PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。 AFLP原理： 首先利用可產(chǎn)生 粘性末端 的限制性內(nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段。 （四）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ AFLP） 應(yīng)用于基因突變性質(zhì)不明的連鎖分析。 人類基因組中由 中性突變 導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸 的差異稱－－ DNA多態(tài)性 RFLP類型： 由于鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入和重 排導(dǎo)致 DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－ － 序列多態(tài)性 。 （ 6）、實(shí)時(shí)定量 PCR： 借助特異性結(jié)合 DNA的熒光染料，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè) PCR 擴(kuò)增的 DNA量的變化。用于一些“超大” 基因中大片段缺失分析。簡(jiǎn)單、快捷、靈敏。用 于檢測(cè)特定基因表達(dá)水平的主要方法之一。用于檢測(cè)特 定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。 PCR的基本過(guò)程：（循環(huán)程序） 變性（ 95℃ ） → 退火（ 55℃ － 65 ℃ ） → 延伸（ 72 ℃ ） 3～ 5分 40’’～ 1分 100bp/1分 源自水棲高溫菌，最適反應(yīng)溫度為 72℃ ，且經(jīng) 90℃ 以上加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。 （無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。 如：同位素、熒光、生物素等 核酸印跡雜交基本過(guò)程： 核酸印跡雜交可檢測(cè) pg水平的靶分子 （ 4）檢測(cè)： 方法依標(biāo)記的探針而不同 *放射性同位素 *生物素 *地高辛 *熒光素 （ 3）雜交： 預(yù)雜交－－封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 雜交－－探針與核酸分子結(jié)合 核酸印跡雜交基本過(guò)程： 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR) 原理： 以待擴(kuò)增 DNA為模板 ，在互補(bǔ)模板兩端序列的 寡核苷酸引物 介導(dǎo)下，通過(guò) 耐高溫 DNA聚合酶 催化下，按半保留復(fù)制機(jī)制延模板鏈延伸，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的 DNA。 （ RNA可直接用 變性膠電泳 ，轉(zhuǎn)膜） 制備樣品： 核酸印跡雜交基本過(guò)程： （ 2）制備探針： 探針：一段能和待檢測(cè)核酸分子按堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則而結(jié)合的核酸分子片段。 方法： DDRTPCR： 分析正常和異?；蚪M 尋找兩者之間的差異序列 基因組錯(cuò)配篩選技術(shù)： 尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷 基因診斷的基本步驟： 獲得待檢樣品：提取核酸 （ PCR提高靈敏度 ) 制備和標(biāo)記核酸探針 基因檢測(cè)分析 三、基因診斷的常用技術(shù) ? 核酸分子雜交 ? 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） ? 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ RELP） ? 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ AFLP） ? 等位基因特異的寡核苷酸（ ASO） ? 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ SSCP） ? 基因芯片 核酸分子雜交 原理： 利用核酸的變性、復(fù)性及堿基互補(bǔ)的性質(zhì)，用已知基因的核酸序列作 探針 ，與變性后的單鏈基因組 DNA/RNA雜交，檢測(cè)核酸樣品中是否存在與探針互補(bǔ)的同源核酸序列，進(jìn)行 DNA或RNA定性定量分析。 表型克隆技術(shù) －－是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接 分離該表型的相關(guān)基因，并對(duì)疾病相關(guān)的 一組基因 進(jìn)行 克隆，然后用作多種探針，來(lái)診斷多基因遺傳病。 定位性克隆 策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ)。 定位性克隆 －－根據(jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆。 檢測(cè)與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因 遺傳連鎖 －－同一