【正文】 因轉(zhuǎn)移的另一個特點就是可以利用受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，在體內(nèi)直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。近年來造血干細(xì)胞分離技術(shù)不斷完善，對基因治療的發(fā)展無疑具有重要意義。造血干細(xì)胞能分化成各系血細(xì)胞，具有移植方便、繁殖能力強(qiáng)等特點，因此是基因治療合適的靶細(xì)胞。一、 造血細(xì)胞造血組織細(xì)胞在體內(nèi)多處分布，有較多的遺傳病與造血組織相關(guān)，骨髓移植方法已經(jīng)建立，使造血細(xì)胞成為基因治療中最重要的受體細(xì)胞。 。 ，且生命周期較長。這種抑制作用，對于腫瘤化療來說無疑是一個很好的輔助手段。人類mdr1基因編碼一種跨膜糖蛋白，其過度表達(dá)與人類腫瘤細(xì)胞的多抗藥性形成有關(guān)。 孕激素對于某些腫瘤尤其是生殖系統(tǒng)腫瘤的生長有促進(jìn)作用，這是通過孕激素受體對孕激素反應(yīng)基因(PRG)的激活而實現(xiàn)的。能與her2原癌基因的啟動子區(qū)域形成三螺旋的TFO可通過競爭性結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)位點的結(jié)合，為過度表達(dá)HER2的乳腺癌的治療帶來了可能。靶基因的優(yōu)勢結(jié)合位點在15～40 堿基對的范圍內(nèi)，ODN通常結(jié)合到雙螺旋中同聚嘌吟（A和G）鏈上；形成三螺旋的ODN不干擾原有雙螺旋間的氫鍵，ODN中每個堿基與雙螺旋靶區(qū)中的嘌呤堿基形成兩個新的氫鍵。三堿基體有C＋GC、GGC及TAT、AAT。（二）作用機(jī)制 DNA雙螺旋內(nèi)具有同聚嘌吟和同聚嘧啶的H回文區(qū)域可發(fā)生自身折疊，形成局部的分子內(nèi)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，同時游離出一段DNA單鏈。因此，當(dāng)基因治療的目的是盡可能完全地抑制特定基因的表達(dá)時，必須將注意力轉(zhuǎn)向mRNA的源頭，即從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行抑制。（－） 三鏈DNA與基因表達(dá) ODN以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶標(biāo)，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止基因轉(zhuǎn)錄。四、 三 鏈 DNA脫氧寡核苷酸(ODN)能與雙鏈DNA專一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，來阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA復(fù)制，此種ODN又被稱為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（triple helixforming oligonucleotides，TFO）。2．內(nèi)源導(dǎo)入：指通過真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酶。與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊，而更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。在該項技術(shù)的應(yīng)用中，存在著一個難題，由于 mRNA的拷貝數(shù)太多，難以達(dá)到完全的抑制。引導(dǎo)序列的長度、引導(dǎo)序列識別區(qū)域的確定（如抗病毒時選擇調(diào)節(jié)或功能必需區(qū)域），在實際應(yīng)用時還需具體考慮。核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNA分子的序列互補，起著識別和結(jié)合底物的作用。設(shè)計的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。2. 核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。 (－) 核酶的設(shè)計應(yīng)用核酶進(jìn)行基因治療是通過靶RNA 分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，需要從靶分子和核酶分子兩個方面來考慮核酶的設(shè)計。在這種情況下，組成核酶的兩個RNA分子中，帶有被剪切位點的RNA分子實際上是被剪切的靶分子，而與之結(jié)合的RNA分子雖然只是構(gòu)成了核酶的一部分，但實際上是作為一個酶在起作用，這種RNA分子也被稱為核酶，基因治療中應(yīng)用的就是這種核酶。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P2Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。3. 病毒性疾病的基因治療通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥物的反應(yīng)性。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虮磉_(dá)的惡性腫瘤。RNA干擾技術(shù)成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型，標(biāo)志著RNA干擾技術(shù)將成為研究基因功能不可或缺的工具。1. 研究基因功能的新工具由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以特異地使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。（三）RNA干擾的應(yīng)用前景RNA干擾現(xiàn)象在生物界普遍存在，以及RNA干擾的作用機(jī)制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 siRNA可以進(jìn)行化學(xué)合成以及體外轉(zhuǎn)錄合成等，也可以通過質(zhì)粒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在細(xì)胞內(nèi)合成。小 結(jié)雙鏈 siRNA 能夠特異性地抑制序列與之相同基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為 RNA干擾（RNAi)。實驗表明，長度為21個堿基、3ˊ末端有2個堿基突出的siRNA活性較高。siRNA一般不會在哺乳類細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。siRNA的發(fā)現(xiàn)不僅加深了人們對RNA干擾機(jī)制的認(rèn)識，同時突破了一個用長雙鏈RNA在哺乳類細(xì)胞中抑制基因表達(dá)時常常遇到的障礙，即非特異性作用。在大多數(shù)用哺乳類細(xì)胞做的RNA干擾實驗中，雙鏈RNA比單鏈RNA更有效。用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)長時間、穩(wěn)定地生成siRNA。闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾研究中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAinduced silencing plex, RISC)。 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究和人類疾病治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。二、干擾RNA （一）RNA干擾現(xiàn)象對RNA干擾的認(rèn)識來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進(jìn)行的實驗。已有人利用攜帶核酶的反義RNA增強(qiáng)了反義RNA對HIV1的抑制作用。例如：用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可以增強(qiáng)反義核酸的抗降解作用。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘渣”。利用ASGP受體介導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞水平可以專一地抑制乙肝病毒基因的表達(dá)。ASGPPL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA通過這一途徑進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層,因而可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用，提高轉(zhuǎn)移效率。體內(nèi)的RNase就會使反義RNA的有效量迅速減少，剩下的未被降解的反義RNA也無法集中到病灶處而是分散到全身。： 反義RNA抗RNase的能力并不強(qiáng)。反義RNA用于體內(nèi)基因治療，必須解決以下兩個關(guān)鍵問題。 第三節(jié) 基因干預(yù)一、反義RNA (－) 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控通常采用的方法有兩種：，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)移方法的效率差異較大，有的需要特殊的儀器，只適合體外基因轉(zhuǎn)移，在基因治療中極少使用?；蛑苯幼⑸浞ǖ膬?yōu)點：；；，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點；，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。動物實驗表明：接受注射異體DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。在溶酶體中大部分復(fù)合物將被降解和再循環(huán)利用，只有少數(shù)導(dǎo)入的DNA能夠逃避這條途徑而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。目前研究的配體有胰島素、表皮生長因子、凝集素、運鐵球蛋白和紅細(xì)胞生成素等等。它的主要天然配體為去唾液酸血清類粘蛋白。圖示受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA團(tuán)團(tuán)包圍，只留下配體暴露于表面。（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，即可使DNA具有靶向性?；驹?利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。（非生物學(xué)方法）。（四）單純性皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)載體HSV具有許多天然特征，適合作為神經(jīng)組織的基因轉(zhuǎn)移載體：在不同的神經(jīng)細(xì)胞中可建立長期潛伏狀態(tài)；在病毒進(jìn)入細(xì)胞和建立潛伏狀態(tài)時，不需要宿主細(xì)胞的分裂；在神經(jīng)元細(xì)胞核中，病毒基因可持續(xù)存在，不整合至宿主細(xì)胞的染色體中，避免了因整合而使宿主細(xì)胞基因失活或激活原癌基因的潛在危險。AAV載體的缺陷：AAV載體容量小，目前最多只能容納5 kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。并能較穩(wěn)定地存在。AAV生命周期的特點：● 單獨不能進(jìn)行復(fù)制；以潛伏感染為主；● 病毒基因組與細(xì)胞共存；● 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；● 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因， AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制；● 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。AAV不能獨立復(fù)制，只有在輔助病毒如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒存在的條件下才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。4）靶向性差。2）宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫的關(guān)鍵性因素之一。 腺病毒的優(yōu)點：基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大， kb外源基因腺病毒載體缺點：1）不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)，其宿主細(xì)胞范圍廣泛，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞如神經(jīng)元等。（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體