【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 A的發(fā)現(xiàn)不僅加深了人們對(duì)RNA干擾機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)突破了一個(gè)用長(zhǎng)雙鏈RNA在哺乳類細(xì)胞中抑制基因表達(dá)時(shí)常常遇到的障礙，即非特異性作用。長(zhǎng)于30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA常常會(huì)激活蛋白激酶而誘發(fā)對(duì)蛋白質(zhì)合成的非特異抑制。siRNA一般不會(huì)在哺乳類細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。用人工合成的siRNA可特異性地抑制哺乳類細(xì)胞中外源性或內(nèi)源性基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)度為21個(gè)堿基、3ˊ末端有2個(gè)堿基突出的siRNA活性較高。siRNA誘發(fā)的基因抑制具有高度的序列特異性。小 結(jié)雙鏈 siRNA 能夠特異性地抑制序列與之相同基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為 RNA干擾（RNAi)。長(zhǎng)度為21~23個(gè)堿基的雙鏈 siRNA 通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合體 RISC后，與之相結(jié)合分解靶基因，抑制靶基因的表達(dá)。 siRNA可以進(jìn)行化學(xué)合成以及體外轉(zhuǎn)錄合成等，也可以通過(guò)質(zhì)粒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在細(xì)胞內(nèi)合成。RNAi可以廣泛應(yīng)用到各種基因功能研究以及發(fā)育生物學(xué)的研究中，也有望應(yīng)用到各種疾病的基因治療中。（三）RNA干擾的應(yīng)用前景RNA干擾現(xiàn)象在生物界普遍存在，以及RNA干擾的作用機(jī)制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。1. 研究基因功能的新工具由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以特異地使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。研究表明RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。RNA干擾技術(shù)成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，標(biāo)志著RNA干擾技術(shù)將成為研究基因功能不可或缺的工具。2. 腫瘤的基因治療傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)使用多種雙鏈RNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虮磉_(dá)的惡性腫瘤。KRAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)，用RNA干擾技術(shù)可以阻礙KRAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。通過(guò)RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對(duì)化療藥物的反應(yīng)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF7乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1的功能。3. 病毒性疾病的基因治療RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P2Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。也可通過(guò)RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNA干擾技術(shù)能用于許多病毒性疾病的基因治療，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對(duì)于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。 三、核酶(ribozyme)天然核酶多為單一的RNA分子，具有自剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。只要兩個(gè)RNA分子通過(guò)互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。在這種情況下，組成核酶的兩個(gè)RNA分子中，帶有被剪切位點(diǎn)的RNA分子實(shí)際上是被剪切的靶分子，而與之結(jié)合的RNA分子雖然只是構(gòu)成了核酶的一部分，但實(shí)際上是作為一個(gè)酶在起作用，這種RNA分子也被稱為核酶，基因治療中應(yīng)用的就是這種核酶。在基因治療時(shí)，利用這種核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過(guò)破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。 (－) 核酶的設(shè)計(jì)應(yīng)用核酶進(jìn)行基因治療是通過(guò)靶RNA 分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，需要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來(lái)考慮核酶的設(shè)計(jì)。,即具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。2. 核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。 在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成特定的核酶。設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。圖示核酶抑制翻譯的過(guò)程。核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNA分子的序列互補(bǔ)，起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。這兩段序列可以根據(jù)底物核苷酸序列而變動(dòng)，關(guān)鍵是能夠特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子，形成錘頭結(jié)構(gòu)的三個(gè)螺旋區(qū)。引導(dǎo)序列的長(zhǎng)度、引導(dǎo)序列識(shí)別區(qū)域的確定（如抗病毒時(shí)選擇調(diào)節(jié)或功能必需區(qū)域），在實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需具體考慮。（二）核酶的應(yīng)用在基因治療研究領(lǐng)域中，反義核酸技術(shù)是一個(gè)非常重要的技術(shù)。在該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用中，存在著一個(gè)難題，由于 mRNA的拷貝數(shù)太多，難以達(dá)到完全的抑制。核酶的出現(xiàn)，為這一問(wèn)題的解決提供了契機(jī)。與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊，而更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。 核酶導(dǎo)入細(xì)胞的方法：l. 外源導(dǎo)入：多采用脂質(zhì)體法，將體外轉(zhuǎn)錄合成的核酶通過(guò)脂質(zhì)體包裹后，導(dǎo)入細(xì)胞，此種方法將核酶導(dǎo)入細(xì)胞的效率較高，每個(gè)細(xì)胞中可導(dǎo)入 30萬(wàn)個(gè)核酶分子。2．內(nèi)源導(dǎo)入：指通過(guò)真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酶。根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)合成核酶的正鏈和負(fù)鏈的DNA片段；形成DNA雙鏈后，將其克隆至合適的真核表達(dá)載體；最后將此載體用適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)入靶細(xì)胞或組織，讓其表達(dá)出核酶，阻斷基因表達(dá)。四、 三 鏈 DNA脫氧寡核苷酸(ODN)能與雙鏈DNA專一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，來(lái)阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA復(fù)制，此種ODN又被稱為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（triple helixforming oligonucleotides，TFO）。為了與作用在mRNA翻譯水平的反義RNA的反義技術(shù)相區(qū)別，又將三鏈DNA技術(shù)稱之為反基因技術(shù)。（－） 三鏈DNA與基因表達(dá) ODN以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶標(biāo)，通過(guò)與該序列形成三螺旋DNA來(lái)阻止基因轉(zhuǎn)錄。由于反義RNA技術(shù)和核酶技術(shù)對(duì)于源源不斷的mRNA難以一一阻斷或剪斷，也就難以達(dá)到完全抑制。因此，當(dāng)基因治療的目的是盡可能完全地抑制特定基因的表達(dá)時(shí)，必須將注意力轉(zhuǎn)向mRNA的源頭，即從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行抑制。反基因技術(shù)給腫瘤及病毒性疾病的治療提示了一個(gè)新的方向。（二）作用機(jī)制 DNA雙螺旋內(nèi)具有同聚嘌吟和同聚嘧啶的H回文區(qū)域可發(fā)生自身折疊，形成局部的分子內(nèi)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)游離出一段DNA單鏈。同理，合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶ODN在一定條件下也可以與雙螺旋DNA分子中的同聚聚嘌呤和同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部的分子間三鏈DNA，這一結(jié)構(gòu)也是由氫鍵所穩(wěn)定。三堿基體有C＋GC、GGC及TAT、AAT。能形成三螺旋的ODN必須滿足C、G對(duì)GC或T、A對(duì)AT的識(shí)別。靶基因的優(yōu)勢(shì)結(jié)合位點(diǎn)在15～40 堿基對(duì)的范圍內(nèi)，ODN通常結(jié)合到雙螺旋中同聚嘌吟（A和G）鏈上；形成三螺旋的ODN不干擾原有雙螺旋間的氫鍵，ODN中每個(gè)堿基與雙螺旋靶區(qū)中的嘌呤堿基形成兩個(gè)新的氫鍵。 （三）三鏈DNA的應(yīng)用研究 不少基因中存在同聚嘌呤和同聚嘧啶的區(qū)域，能夠通過(guò)TFO對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。能與her2原癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域形成三螺旋的TFO可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)位點(diǎn)的結(jié)合，為過(guò)度表達(dá)HER2的乳腺癌的治療帶來(lái)了可能。能與人cmyc基因轉(zhuǎn)錄起站位點(diǎn)－115 bp處結(jié)合形成三鏈DNA的TFO可在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)抑制cmyc的轉(zhuǎn)錄。 孕激素對(duì)于某些腫瘤尤其是生殖系統(tǒng)腫瘤的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這是通過(guò)孕激素受體對(duì)孕激素反應(yīng)基因(PRG)的激活而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)證明，TFO與PRG的孕激素反應(yīng)元件的結(jié)合，可阻止孕激素受體與PRG的特異性結(jié)合，并抑制這一基因的轉(zhuǎn)錄。人類mdr1基因編碼一種跨膜糖蛋白，其過(guò)度表達(dá)與人類腫瘤細(xì)胞的多抗藥性形成有關(guān)。能與這種基因編碼區(qū)的高嘌呤序列形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)的TFO可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。這種抑制作用，對(duì)于腫瘤化療來(lái)說(shuō)無(wú)疑是一個(gè)很好的輔助手段。第四節(jié)基因治療的靶細(xì)胞 選擇轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞時(shí)考慮的因素： vivo還是ex vivo基因轉(zhuǎn)移，選擇目的基因表達(dá)的組織細(xì)胞，最好是組織特異性細(xì)胞。 ，且生命周期較長(zhǎng)。 。 。 在基因治療過(guò)程中，要有針對(duì)性地選擇靶細(xì)胞，確保導(dǎo)入的基因能夠有效表達(dá)并發(fā)揮治療作用。一、 造血細(xì)胞造血組織細(xì)胞在體內(nèi)多處分布，有較多的遺傳病與造血組織相關(guān)，骨髓移植方法已經(jīng)建立，使造血細(xì)胞成為基因治療中最重要的受體細(xì)胞。將基因轉(zhuǎn)移至骨髓多能造血干細(xì)胞，則可以使轉(zhuǎn)移基因始終存在于所有造血細(xì)胞內(nèi)。造血干細(xì)胞能分化成各系血細(xì)胞，具有移植方便、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此是基因治療合適的靶細(xì)胞。對(duì)骨髓細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)主要是將基因轉(zhuǎn)移到未分離的骨髓細(xì)胞，如果轉(zhuǎn)移后4個(gè)月在骨髓和（或）淋巴組織內(nèi)仍有轉(zhuǎn)移基因的存在或表達(dá)，即認(rèn)為已成功地轉(zhuǎn)染了造血干細(xì)胞。近年來(lái)造血干細(xì)胞分離技術(shù)不斷完善，對(duì)基因治療的發(fā)展無(wú)疑具有重要意義。二、肝細(xì)胞n 肝臟是重要的代謝器官，許多遺傳病都是由于肝特異的基因產(chǎn)物缺陷而