【正文】 圖示腺病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及感染過程。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)：隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)：①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體所識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，它由兩部分組成：(1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：保留病毒顆粒的包裝信號(hào)ψ，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源的治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，即由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成環(huán)狀雙鏈DNA分子，并隨機(jī)整合至宿主細(xì)胞基因組，稱為前病毒(provirus)，然后再轉(zhuǎn)錄成RNA，并合成包裝蛋白，將轉(zhuǎn)錄的RNA基因組包裝后分泌至細(xì)胞外，完成一個(gè)完全的生活周期。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，而其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (retrovirus vector, RV)。 第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)圖示基因治療的兩種途徑。 （1）基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法。腫瘤細(xì)胞的消除有賴于旁觀者效應(yīng)，即轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因可以影響沒有被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞。圖示：自殺基因的作用機(jī)制（約2分鐘）（一）自殺基因系統(tǒng)TK/GCV：?jiǎn)渭儼捳畈《荆╤erps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，或作為DNA鏈延伸的終止子阻止DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此類基因治療的靶基因往往是過度表達(dá)的癌基因或者是病毒的基因。3．基因添加基因添加或稱基因增補(bǔ)（gene augmentation）: 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。這樣，帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)進(jìn)行部分基因序列的交換。又稱基因矯正（gene correction）。DNA重組、基因轉(zhuǎn)移、基因克隆和表達(dá)等技術(shù)的迅猛發(fā)展，為基因治療的飛速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。基因治療的前景與問題；人類生殖細(xì)胞基因治療研究的倫理學(xué)問題。中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心教 案授課科目: 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)授課內(nèi)容: 基因治療授課對(duì)象：臨床醫(yī)學(xué)七年制、八年制授課時(shí)數(shù)：4 學(xué)時(shí)授課教師：授課地點(diǎn)：湘雅醫(yī)學(xué)院新教學(xué)區(qū)授課時(shí)間：授課教材：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（21世紀(jì)高等院校教材），胡維新主編，北京：科學(xué)出版社，2007年2月，第一版；醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（衛(wèi)生部8年制規(guī)劃教材），馮作化主編，北京： 人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版一．目的要求掌握：基因治療的概念、基本策略、常用載體；治療基因的受控表達(dá)原理與方法。二．講授重點(diǎn)：基因治療的策略：如基因置換、基因添加、基因干預(yù)、自殺基因治療、免疫基因治療等；體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。 基因治療分類體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代生殖細(xì)胞(germline)基因治療 對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第一節(jié) 基因治療的策略1．基因治療的概念定義：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病起治療作用。目的：糾正缺陷基因，將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。n 要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。類型:針對(duì)特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)的正?；?，使導(dǎo)入的正?；蛘系交蚪M中，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。較常用的方法是采用反義核酸、核酶或者干擾RNA技術(shù)等抑制基因的表達(dá)。CD/5FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無毒性5氟胞嘧啶（5FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5氟尿嘧啶（5FU）。旁觀者效應(yīng)明顯地增強(qiáng)了自殺基因?qū)δ[瘤的殺傷作用，在相當(dāng)程度上彌補(bǔ)了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題。 （2）基因修飾TIL的過繼免疫療法。ex vivo(經(jīng)活體)，即將靶細(xì)胞在體外導(dǎo)入外源基因及體外增殖、篩選、藥物處理或其他操作后，再輸回患者體內(nèi)。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，其感染顆粒是由包裝蛋白包裝的兩條RNA鏈組成，兩條RNA鏈5ˊ端經(jīng)氫鍵連接。圖示逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR；（2）LTR由UR和U5三部分組成：在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子； U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ；在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。另一部分為包裝細(xì)胞，它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒顆粒包裝蛋白基因，卻缺失包裝信號(hào)ψ的逆轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成，該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。 腺病毒的優(yōu)點(diǎn)：基因?qū)胄矢撸瑢?duì)人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大， kb外源基因腺病毒載體缺點(diǎn)：1）不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。4）靶向性差。AAV生命周期的特點(diǎn)：● 單獨(dú)不能進(jìn)行復(fù)制；以潛伏感染為主；● 病毒基因組與細(xì)胞共存；● 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；● 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因， AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制；● 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。AAV載體的缺陷：AAV載體容量小，目前最多只能容納5 kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。（非生物學(xué)方法）。（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，即可使DNA具有靶向性。圖示受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程。目前研究的配體有胰島素、表皮生長因子、凝集素、運(yùn)鐵球蛋白和紅細(xì)胞生成素等等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射異體DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。這些轉(zhuǎn)移方法的效率差異較大，有的需要特殊的儀器，只適合體外基因轉(zhuǎn)移，在基因治療中極少使用。反義RNA用于體內(nèi)基因治療，必須解決以下兩個(gè)關(guān)鍵問題。體內(nèi)的RNase就會(huì)使反義RNA的有效量迅速減少，剩下的未被降解的反義RNA也無法集中到病灶處而是分散到全身。ASGPPL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識(shí)別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA通過這一途徑進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘?jiān)?。例如：用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可以增?qiáng)反義核酸的抗降解作用。二、干擾RNA （一）RNA干擾現(xiàn)象對(duì)RNA干擾的認(rèn)識(shí)來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究和人類疾病治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾研究中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。在大多數(shù)用哺乳類細(xì)胞做的RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，雙鏈RNA比單鏈RNA更有效。siRNA一般不會(huì)在哺乳類細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。小 結(jié)雙鏈 siRNA 能夠特異性地抑制序列與之相同基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為 RNA干擾（RNAi)。（三）RNA干擾的應(yīng)用前景RNA干擾現(xiàn)象在生物界普遍存在，以及RNA干擾的作用機(jī)制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。RNA干擾技術(shù)成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，標(biāo)志著RNA干擾技術(shù)將成為研究基因功能不可或缺的工具。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對(duì)化療藥物的反應(yīng)性。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P2Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。這對(duì)于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。在這種情況下，組成核酶的兩個(gè)RNA分子中，帶有被剪切位點(diǎn)的RNA分子實(shí)際上是被剪切的靶分子，而與之結(jié)合的RNA分子雖然只是構(gòu)成了核酶的一部分，但實(shí)際上是作為一個(gè)酶在起作用，這種RNA分子也被稱為核酶，基因治療中應(yīng)用的就是這種核酶。2. 核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNA分子的序列互補(bǔ)，起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。在該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用中，存在著一個(gè)難題，由于 mRNA的拷貝數(shù)太多，難以達(dá)到完全的抑制。2．內(nèi)源導(dǎo)入：指通過真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酶。（－） 三鏈DNA與基因表達(dá) ODN以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶標(biāo)，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止基因轉(zhuǎn)錄。（二）作用機(jī)制 DNA雙螺旋內(nèi)具有同聚嘌吟和同聚嘧啶的H回文區(qū)域可發(fā)生自身折疊，形成局部的分子內(nèi)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)游離出一段DNA單鏈。靶基因的優(yōu)勢(shì)結(jié)合位點(diǎn)在15～40 堿基對(duì)的范圍內(nèi)，ODN通常結(jié)合到雙螺旋中同聚嘌吟（A和G）鏈上；形成三螺旋的ODN不干擾原有雙螺旋間的氫鍵，ODN中每個(gè)堿基與雙螺旋靶區(qū)中的嘌呤堿基形成兩個(gè)新的氫鍵。 孕激素對(duì)于某些腫瘤尤其是生殖系統(tǒng)腫瘤的生長有促進(jìn)作用，這是通過孕激素受體對(duì)孕激素反應(yīng)基因(PRG)的激活而實(shí)現(xiàn)的。這種