【正文】 可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點?！⒖紭藴势范繙y定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標準曲線用的參考標準品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的45個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。陽性對照品中含量約為10ng/ml。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標明。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。 　酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。另一種HRP的底物為3(4羥基)苯丙酸[3(4hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。曾有報道OPD有致異變性，操作時應(yīng)予注意。OPD本身難溶于水，OPDazinodi(3 ethylbenziazobine sulfonate6)]。,5,539。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應(yīng)用這種稀釋液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長?，F(xiàn)在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在48℃保存期可達6個月。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存?！〗Y(jié)合物的保存酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應(yīng)。最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。使用過濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標抗體的量。 按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。酶標記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=12/1。辣根過氧化物酶的標記常用此法。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達60%70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標記抗體。堿性磷酸一般用此法進行標記。 　結(jié)合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。)2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進行試驗。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、βD半乳糖苷酶和脲酶等。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。　酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。ELISA技術(shù)講座四試劑的選擇下 　結(jié)合物結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（）。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。 封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。封閉的手續(xù)與包被相類似。 　　封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。~8的TrisHCL緩沖液作為稀釋液的。應(yīng)用單抗包被時應(yīng)注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。 　包被用抗體包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?　包被用抗原 用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。 　包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。其優(yōu)點是表面積極大，反應(yīng)在懸液中進行，其速率與液相反應(yīng)近似。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。在ELISA中，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結(jié)果。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質(zhì)軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%?？刂品磻?yīng)條件。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。以下簡述固相載體和包被過程?！∶庖呶絼┮寻豢乖蚩贵w的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。前文（）已述，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。由于ABSELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABSELISA應(yīng)用不多。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標抗體（抗原）。生物素與親和素的結(jié)合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。生物素為小分子化合物，分子量244。 ABSELISA法ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。類風濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合?？笻Be的檢測一般采用此法。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc 　　ELISA一般采用此法。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。 競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。4）加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標抗體抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。3）加酶標抗抗體。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖23）。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，