【正文】 單色器。 ? 熒光分析的儀器、特點(diǎn)及注意事項(xiàng) １ . 熒光的分析儀器 由光源發(fā)出的光，經(jīng)第一單色器（激發(fā) 單色器）后，得到所需要的激發(fā)光波長。 芳香族化合物易吸附，并且所用溶劑的 極性越小，吸附就越大。 （ 7） 表 面吸附 在稀溶液中 （ 1?g/mL）， 表面吸附尤 為明顯，特別是有機(jī)溶劑，此吸附更為厲害。 當(dāng)物質(zhì)分子吸收了頻率較低的光能后， 并不足使分子中的電子躍遷到電子的激發(fā)態(tài)， 而只是上升到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí)上去， 若在 1015~1012s返回到原能級(jí)，此時(shí)輻射出 和激發(fā)光相同波長的光，稱為 瑞利散射 。 （ 6） 光散射 光散射常常關(guān)系到一個(gè)實(shí)驗(yàn)的靈敏度和 再現(xiàn)性。 如對(duì)試液進(jìn)行稀釋則可消除或降低熒光 的熄滅作用。 此種熄滅的原因： ?）由于濃度大，分 子碰撞幾率大，因而引起能量損失大； ?） 溶液濃度過高，物質(zhì)分子發(fā)生二聚體乃至多 聚體，這些多聚體不發(fā)光。 例如 ：甲基蘭熒光溶液被 Fe2+熄滅 D* + Fe2+? D + Fe3+ 有熒光 無熒光 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熄滅劑并不限于金 屬離子， I， Br， S2O32等易于給出電子的 陰離子對(duì)奎寧、羅丹明及熒光素鈉等有機(jī)熒 光物質(zhì)也會(huì)發(fā)生熄滅作用。 實(shí)驗(yàn)證明 ： O2的熄滅作用，似乎是隨溶 劑的介電常數(shù)的減小而增加，所以 O2在水溶 液中熄滅作用 較小，而在有機(jī)溶劑中熄滅作 用較強(qiáng)。 溶液中的 溶解氧 常對(duì)熒光產(chǎn)生熄滅作用。 上述情況可能是： 絡(luò)合 M（有熒光） +Q ? MQ（無熒光） 分解 T?， MQ ? M?+Q （熒光增強(qiáng)） 如果 MQ的形成是由于強(qiáng)大的力，則 MQ 將具有它自己的特征吸 收，因此溶液的吸收 光譜也發(fā)生了改變。 又如 ：某些熒光物質(zhì)的溶液在加入熄滅 劑之后，它的熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而增 強(qiáng)。 （ b） 組成化合物的熄滅 有 些熒光熄滅現(xiàn)象不能用碰撞熄滅理論 來解釋。 式中： k為熄滅常數(shù)； [Q]為熄滅劑濃度， 單位 mol/L； F0、 F分別為熄滅劑不存在時(shí)和 存在時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度。 它是指處于單重激發(fā)態(tài)的熒光分子 M*與 熄滅劑 Q發(fā)生碰撞后，使激發(fā)態(tài)分子以無輻 射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生熄滅作用。下面討論幾種導(dǎo)致熒光熄滅作用 的主要類型。這些引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為 熄 滅劑 。 （ 4） pH的影響 當(dāng)熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時(shí)，溶液 pH的 改變對(duì)溶液的熒光強(qiáng)度有很大的影響，這是 因?yàn)樗鼈兊姆肿雍退鼈兊碾x子在電子構(gòu)型上 的差異。 顯然隨著溶液溫度升高，會(huì)增加分子間 碰撞 的次數(shù)，促進(jìn)分子內(nèi)能的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo) 致熒光強(qiáng)度下降。 （ b）對(duì)純?nèi)軇┑睦暹M(jìn)行測(cè)定，然后在 熒光光譜 中進(jìn)行校正。 若拉曼光處于熒光波長中，則產(chǎn)生干擾。 在 含有重原子的溶劑（ 例如 ：碘乙烷 CH3CH2I 和四溴化碳 CBr4） 中，也是由于重 原子效應(yīng)，增加系間竄躍速度，會(huì)使熒光減 弱、磷光則相應(yīng)增強(qiáng)。 3. 熒光分析中的主要影響因素 （ 1） 溶液濃度 要求 c?L，當(dāng)高濃度時(shí)，由于自熄 滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與分子濃度 不呈線性關(guān)系。 則 Cx/CS=( FX FX0)/( FS +x – Fx) 或 Cx =CS( FX FX0)/( FS +x – Fx) 除了這種內(nèi)標(biāo)計(jì)算法外，也可采用類似 工作曲線的內(nèi)標(biāo)曲線法來求批量試樣的濃度。同時(shí)根據(jù)工作曲線 的線性情況，可確定試液的最高濃度范圍。 b. 工作曲線法 先配一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別 測(cè)定其熒光值，然后將減去試劑空白熒光值 的標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光值與其相應(yīng)濃度作圖，即得 其工作曲線。常用的定量方法有 直接比較法 、 工 作曲線法 和 內(nèi)標(biāo)法 。有時(shí)需改變?nèi)軇┖笤俦? 較它們的光譜圖，如二者一致，即為同一物 質(zhì)。 2. 熒光分析方法 （ 1） 定性方法 不同分子結(jié)構(gòu)的各種熒光物質(zhì)，具有不 同的激發(fā)光譜（即 : 吸收光譜）和熒光光譜， 這是分子熒光分析的定性依據(jù)。 任意時(shí)間（ t）的熒光強(qiáng)度： If =If0et/?=If0eKt 式中： If—移去激發(fā)光源后任一時(shí)間 t時(shí)的熒光 強(qiáng)度； If0—激發(fā)時(shí)最大的熒光強(qiáng)度； K—儀器衰減 常數(shù)； ?—激發(fā)態(tài)的平均壽命。 (7) 熒光壽命 它是研究分子結(jié)構(gòu)時(shí)要求的參數(shù)。它是在 激發(fā)和發(fā)射光路中引入兩個(gè)偏正器。 (6) 熒光偏振 在研究分子的結(jié)構(gòu)變化時(shí)用。 或：熒光譜的半高寬稱為譜帶寬度。 (4) 峰值波長和譜帶寬度 峰 值波長 — 在譜圖（包括激發(fā)譜和發(fā)射譜） 中具有最大熒光強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的波長，稱為峰 值波長。 在濃度較高時(shí)，產(chǎn)生這種偏離的原因可 能是激發(fā)分子間互相碰撞而失去能量（ 自身 猝滅 ），或者是熒光被未激發(fā)的分子所吸收 （ 自身吸收 ）。當(dāng)濃度較大時(shí)，即它的吸光度大于 時(shí)，熒光強(qiáng)度與其濃度的線性關(guān)系將發(fā)生偏 離。 所以： F= ? Ia= ? I0(?cl) (32) 式中： ?為熒光效率，而其中 ?cl展開得 ?cl=?cl+(?cl)2/2!+ (?cl)3 /3!+… (33) ?若溶液濃度 c很低， ?、 l都是定值，則 ?cl 的值很小，當(dāng) A=?cl，上面級(jí)數(shù)展開 式中第二項(xiàng)以后的各項(xiàng)可以忽略不計(jì)，因此： e?CL = 1 ?cl （ 34） 將（ 34）代入（ 32）得 ： F= ?I0?cl （ 35） 式中： Φ： 量子效率； I0： 入射光強(qiáng)度； ε： 摩爾吸光系數(shù)； b： 光程； c： 濃度 當(dāng)入射光強(qiáng)度 I0一定時(shí)， F= Kc （ 36） ? 公式成立前提條件： εbc=A 即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（ c）， F與 c方成線性。 (2) 熒光強(qiáng)度 熒光物質(zhì)吸收輻射能后才發(fā)射熒光，因 此溶液的熒光強(qiáng)度和該溶液的吸光程度以及 溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。 對(duì)于同一試樣，用不同的熒光儀記錄的 “表觀光譜”需進(jìn)行校正，經(jīng)過校正的光譜 稱為“真實(shí)熒光光譜”又叫“校正光譜”。 b. 發(fā)射光譜 選擇并固定激發(fā)波長 ?EX和狹縫寬度 S， 讓發(fā)射單色器進(jìn)行波長掃描，記錄熒光強(qiáng) 度（ F）隨發(fā)射波長的變化而變化的關(guān)系曲 線，叫發(fā)射光譜，見圖 34。 ? 熒光分析的方法及影響因素 1. 熒光參數(shù) (1) 激 發(fā)光譜 和 發(fā)射光譜 熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是用熒光 法進(jìn)行物質(zhì)的定性、定量分析的基本參數(shù)和 依據(jù)。 螯合物中金屬離子的 發(fā)光機(jī)理 ，通常是 螯合物首先通過配位體的 ???*躍遷而被激 發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)移給金屬離子，導(dǎo) 致 d? d*躍遷或 f? f*躍遷，最終發(fā)射的是 d*?d躍遷或 f*?f躍遷光譜。這也是由 于剛性和其平面性增加所致。若這些化合物和金屬離子 形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié) 構(gòu)增大，常會(huì)發(fā)出熒光。 但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能 產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬離子的 測(cè)定。 注：分子所處的環(huán)境，如溶劑、溫度、 pH等都可能會(huì)影響分子的結(jié)構(gòu)或立體構(gòu)象， 當(dāng)然也就會(huì)影響分子能否產(chǎn)生熒光。 c. 芳環(huán)上取代基的類型和位置 （ !）類型 ?有些取代基可增強(qiáng)熒光： 如 OH、 OR、 NH NHR、 NR2等； ?有些取代基可減弱熒光：如 COOH、 C=O、 NO Cl、 Br、 I等； ?有些取代基影響不明顯：如 F、 SH、 SO3H 等。