生工測序問題分析-文庫吧資料
2025-01-15 02:46本頁面
【正文】 客戶的樣品問題。由于 PCR 產(chǎn)物本身有突變或含有等位基因，就會造成在某些位置上有重疊峰，產(chǎn)生 N 值?，F(xiàn)在我們只承諾正常情況下每個測序反應(yīng)至少讀出 500 個堿基的有效序列。一個測序反應(yīng)一般可以讀出 900bp 以上的堿基，但是，只有550bp 以前的堿基是可靠的，理想條件下，多至 700bp 的堿基都是可以用的。但是客戶提供的 PCR 引物用于測序時，有時會產(chǎn)生引物二聚體，對測序的起始區(qū)造成干擾。有時，在序列的起始端的小片段容易丟失，導(dǎo)致起始區(qū)信號過低，機器有時也無法正確判讀。該種情況主要是有未去除的染料單體造成的干擾峰。因此我們要根據(jù)序列正確判斷出 PCR產(chǎn)物的末端序列，在此序列以外就不是我們所要的序列了。通常我們很容易辨別 PCR 產(chǎn)物結(jié)束的位點， PCR 產(chǎn)物測序一般末端的一個堿基為 A（綠色峰），這是由于 Taq 酶能夠在 PCR 反應(yīng)的末端非特異性地加上一個 A 堿基，我們用 T 載體克隆 PCR 產(chǎn)物就是根據(jù)該原理的。 結(jié)果完全不對 請?zhí)峁┰敿?xì)資料我們會根據(jù)結(jié)果具體分析。重新設(shè)計引物測序，對 PCR 產(chǎn)物而言建議克隆到載體上用通用引物進(jìn)行測序 質(zhì)粒產(chǎn) 客戶自己提供 2ug 純化好的質(zhì)粒 量極低 PCR 產(chǎn)物定量極低 重新電泳檢測已純化的 PCR 產(chǎn)物，確認(rèn)有足夠的量，或提供 PCR 原液由公司進(jìn)行純化 測序結(jié)果正常，與預(yù)期不符 找不到引物 質(zhì)粒模板 檢測是否為空載體，從其互補鏈上尋找，克隆位點離測序引物太近，長插入片段未測通。重新合成引物測序。 質(zhì)粒測序時整個結(jié)果雙峰 引物特異性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物測序。 某一點后序列變亂 PCR 產(chǎn)物中一個或多個位置有套峰 序列中存在突變，這是正常的，也可以克隆后進(jìn)行測序。 此類問題主要與樣品有關(guān) 質(zhì)粒測序在插入序列中出現(xiàn)套峰 可能是樣品非單克隆，挑其他克隆測序。 測 OD值法不可靠 ,電泳檢測 總量是否足夠 已純化 PCR 產(chǎn)物：根據(jù)片段長度提供足夠量的模板，一 般要求是 100ng/反應(yīng) /Kb，進(jìn)行多個反應(yīng)的應(yīng)相應(yīng)增加量。 培養(yǎng)方式不當(dāng) 質(zhì)粒產(chǎn)量很低 低拷貝數(shù)質(zhì)?；? 客戶自己采取大量提取的方法提供 2ug純化質(zhì)粒。 或菌培養(yǎng)條件特殊 重新提供菌液，或提供 2ug 純化質(zhì)粒。 引物濃度的換算關(guān)系 ∶ 總 ng 數(shù) = pmole x 分子量 /1000 由于 PCR 產(chǎn)物測序相對較難，為使您能拿到一個好的結(jié)果，請盡量滿足上述要求。 ? 純化好的 PCR 產(chǎn)物應(yīng)溶于 雙蒸水 中， TE 緩沖液會嚴(yán)重影響測序反應(yīng)。 ? 與質(zhì)粒模板相比， PCR 產(chǎn)物彼此間差異很大，因此，每個 PCR 模板應(yīng)盡可能提供相應(yīng)的PCR 退火溫度 和 PCR 產(chǎn)物的長度 ，以供測序時參考。有多種純化方法可供選擇， Promega， Qiagen 和生工等公司都有相應(yīng)的產(chǎn)品可供選擇。有雜帶的和擴增彌散的 PCR 產(chǎn)物即使通過瓊脂糖電泳純化，測序仍有可能出現(xiàn)雙峰等異常結(jié)果。 3ul 樣品總量不低于 50ng(非常小的 PCR 產(chǎn)物可以酌情減小 )， PCR 產(chǎn)物產(chǎn)量過低說明PCR 擴增結(jié)果不是很理想，應(yīng)改進(jìn)條件重新擴增。 其他引物請自帶或提供序列由我們合成。 自 帶引物的要求 5pmol/ul(或 5umol/L)，溶液體積 1550ul； 2. 隨機引物（ RAPD 引物）和簡并引物以及引物長度不足 15bp不能用于測序； 3. 盡可能提供引物全序列、 PCR 退火溫度，以供參考。 所有模板均應(yīng)提供相應(yīng)的引物信息 自帶質(zhì)粒的要求 30~50ul ddH2O 中 (請勿溶解在 TE 溶液中 )，電泳檢測濃度大 50ng/ul； 2. 建議用相關(guān)試劑盒提取質(zhì)粒； 3. 如有可能，同時提供 1ml 含有相應(yīng)質(zhì)粒的菌 液備用； 4. 需注明載體和插入目的片段長度、以及測序要求。 測序樣品的要求 類型
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