下一代測序技術(shù)-文庫吧資料
2025-06-12 19:06本頁面
【正文】 大腸桿菌（ Mbp）的基因組。雜交測序技術(shù)的核心在于使用包含全部序列的一定大小的寡聚核苷酸探針（比如512條五核苷酸探針，2048條六核苷酸探針），與固定在芯片表面的基因組片段雜交。相信在未來數(shù)年里，新測序技術(shù)的應(yīng)用將更加廣泛。平臺測序原理PCR類型一個run通量（reads）一個run的有效數(shù)據(jù)量（MB）一個run的時間是否支持雙向測序(PE,Pair end)Roche 454邊合成邊測序乳液PCR400，000100（SE）（SE）是Illumina GA邊合成邊測序橋式PCR50,000,000?10,000(PE)6天（PE）是AB SOLiD邊連接邊測序乳液PCR400,000,00011,000(PE)6天（PE）是HeliScope邊合成邊測序不需要PCR1,000,000,00060,000（PE）14天（PE）是平臺讀長Pair end樣品制備時間每百萬堿基成本（$）儀器價格（$）讀錯率讀錯類型Roche 454300400bp23小時60500,000%插入缺失Illumina GA3645bp2天2430,000%替換AB SOLiD35bp2591,000%替換HeliScope30bp未知11,350,000%缺失 表一 主要新一代測序平臺的比較6. 新一代測序技術(shù)的應(yīng)用 新一代測序技術(shù)大大加快了測序速度，同時降低了成本，在許多研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。第五，從單堿基成本來看，454較高，Solexa相對較低，其它平臺處在相似的水平。并且，SOLiD的讀錯率低于454和Solexa, 而HeliScope最低。第三，在讀錯率方面，由于測序原理的差異，各種平臺的讀錯類型不同。第一，45Solexa、SOLiD測序平臺在測序前要進(jìn)行PCR擴增，Solexa采用了比較特殊的橋式PCR擴增，而HeliScope測序儀由于提高了檢測靈敏度，不需要擴增。Helicos單分子測序除了不需要進(jìn)行擴增，其它過程也類似。因此，我們目前應(yīng)該根據(jù)不同任務(wù)的特點選擇合適的方法。而在大規(guī)?；蚪M測序上，盡管有如上所述的挑戰(zhàn)，新一代測序技術(shù)在成本和效率方面的優(yōu)勢實在太過突出，將會發(fā)揮主要作用，并且這種技術(shù)在未來數(shù)年還有很大改進(jìn)提高的空間。雖然通過數(shù)據(jù)分析的手段可以減少由于讀錯帶來的錯誤，使測序結(jié)果的錯誤率低于萬分之一，但在提高讀長的同時降低錯誤率仍然是第二代測序平臺努力的方向。但是，由于測序原理方面的局限，提高讀長往往會帶來第二個問題，即讀錯率。短讀長雖然在某些應(yīng)用（比如表達(dá)譜）上有優(yōu)勢，但在全基因組de novo測序，重測序等基本應(yīng)用方面，短讀長給數(shù)據(jù)處理和拼接造成了很大困難。幾種新技術(shù)中只有使用焦磷酸法測序的454技術(shù)讀長能夠達(dá)到300bp左右，其它所有技術(shù)的讀長都只有幾十個堿基。 盡管如此，就目前而言，第二代測序技術(shù)所面臨的問題也不容忽視。另一方面，由于芯片上反應(yīng)體系的微量化，在最大程度上減少了反應(yīng)試劑的用量，與Sanger法相比，這是成本降低的重要方面?，F(xiàn)在，已經(jīng)能做到在一塊芯片（flow cell）上集成上億的反應(yīng)體系，這是Sanger法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到的，并且，隨著電子技術(shù)的進(jìn)步，通量還會繼續(xù)提高。2. 第二代測序技術(shù)從大規(guī)模提高通量和微量化反應(yīng)體系入手，將測序成本大大降低了。 第二代測序技術(shù)的優(yōu)勢很明顯，主要包括以下幾個方面：1. 在文庫構(gòu)建方面，新技術(shù)拋棄了Sanger法的體內(nèi)擴增，采用了諸如乳液PCR或橋式PCR等體外擴增方法，甚至如Helicos的單子分測序，根本不需要擴增就能達(dá)到信號檢測的靈敏度。前面已經(jīng)提到，Sanger測序法在今天仍然有著新測序技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢，在某些測序應(yīng)用方面仍然有廣泛的應(yīng)用。事實上，Helicos發(fā)現(xiàn)連續(xù)的合成相同的標(biāo)記核酸產(chǎn)生的淬火作用能夠區(qū)分同源多聚核酸的數(shù)目。Helicos通過一系列電子技術(shù)和熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，提高了CCD的信噪比和檢測靈敏度，從而真正達(dá)到了單分子信號檢測，讀長可以達(dá)到25bp以上。然后將片段的3’端連接上標(biāo)記Cy3熒光分子的多聚A尾巴（Poly A tail）,與芯片（Flow Cell）上連接的數(shù)十億條Poly T寡聚核苷酸退火雜交，從而被原位固定在芯片上。由于上機前不需要對文庫進(jìn)行任何擴增，因此是第一臺真正意義上的單分子測序儀(tSMS, true Single Molecular Sequencing)。但是SOLiD特殊的雙堿基讀譜對信息分析的要求較高，在SNP檢測上有著獨有的優(yōu)勢，而且理論上錯誤率比454技術(shù)和Solexa技術(shù)更低。其中檢測的第5個堿基用特異熒光標(biāo)記，通過5輪的反應(yīng)與特殊的信息解讀，就可以將一定長度的末端序列讀出。 SOLiD測序技術(shù) 與454技術(shù)類似，SOLiD測序也采用體外乳液PCR（emulsion PCR）來擴增DNA文庫，擴增子結(jié)合在1μm的磁珠表面。這種“邊連接邊測序”的特點在于，由于在合成過程中引入多步生化反應(yīng)，使得讀長較短（35bp），但通量更大。每連接上一個單核苷酸的循
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1