【正文】 2．其他一些作圖法也可較準(zhǔn)確地求取 Vmax和 Km 海涅斯 沃爾弗作圖法（ HanesWolff plot） 雙倒數(shù)方程式兩邊同時(shí)乘以 [S] [ S ] V = K m V m a x [ S ] + V m a x 1 直線的 斜率 等于 1/Vmax， 橫軸截距 為 Km 伊迪 霍夫斯蒂作圖法（ EadieHofstee plot） 米氏方程式兩邊均除以 [S] V = [ S ] V m a x K m V 直線的 斜率 為 Km，直線的 縱軸截距 為 Vmax 二、酶濃度對反應(yīng)速度的影響 ?當(dāng) [S]＞＞ [E]， 酶可被底物飽和的情況下 ， 反應(yīng)速度與酶濃度 成正比 。從圖中可知， [E]的變化不影響酶促反應(yīng)的 Km。 Km的范圍多在 106～ 102mol/L之間。 確定最合適底物或天然底物 Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu)、溶液 pH、溫度等條件不變的情 況下，酶促反應(yīng)底物的 Km不因反應(yīng)中酶濃度的改 變而不同。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ──（二） Km的意義 Km值 ① Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。反應(yīng)為零級反應(yīng) [S] V Vmax 酶 被 底 物 飽 和 底物對酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象： （二）底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系可用米氏方程式表示 1．米氏方程式可以很好地解釋底物濃度曲線 中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式 —— 中間產(chǎn)物學(xué)說 E + S k1 k2 k3 ES E + P ※ 1913年 Michaelis和 Menten提出反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式 ， 即米 曼氏方程式 ， 簡 稱 米 氏 方 程 式 (Michaelis equation)。 [S] V Vmax 隨著底物濃度的增高 反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。 研究前提 二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響 （一）酶促反應(yīng)的底物濃度曲線是矩形雙曲線 在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下 ， 反應(yīng)速率 V對底物濃度 [S]作圖呈矩形雙曲線 。 ※ 研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定。 五、酶促反應(yīng)動力學(xué) 一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動力學(xué) ?概念 研究各種因素對 酶促反應(yīng)速率 的影響，并加以定量的闡述。 這種通過偶聯(lián)其他酶并對此酶促產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測 ， 間接地反映待測酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為 酶偶聯(lián)測定法（ enzyme coupled assay） 外加的酶稱為 工具酶或輔助酶 （ auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測的酶稱為 指示酶 （ indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 + ?酮戊二酸 ????? 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸 + NADH + H+ ????? 乳酸 + NAD+ （在 340nm處有吸收峰） （在 340nm處無吸收峰） （三）酶聯(lián)免疫分析測定蛋白質(zhì)是酶分析的發(fā)展 酶聯(lián)免疫分析 又稱 酶聯(lián)免疫吸附測定 （ enzymelinked immunosorbent assays, ELISA） 是利用酶的快速、靈敏、可定量檢測的優(yōu)點(diǎn)和免疫學(xué)方法中抗原 抗體特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，將指示酶與抗體偶連，對抗原進(jìn)行檢測的一種方法 。 還原型 （ Fe2+） 細(xì)胞色素 c在波長 550nm處有明顯的吸收峰 ， 而氧化型 （ Fe3+） 則無；細(xì)胞色素 c氧化酶對細(xì)胞色素 c的氧化反應(yīng) ， 可以直接在波長 550nm處檢測一定時(shí)間內(nèi)還原型細(xì)胞色素 c的減少過程 。 （二）有三類方法對底物和產(chǎn)物的變化量進(jìn)行檢測 1． 直接測定法： 是對底物或產(chǎn)物的含量變化進(jìn)行直接檢測 有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后 ，不用任何輔助反應(yīng)便可直接測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度 。 酶活力測定方法 步驟 ： （ 1）配制底物溶液 __保證底物的純度和濃度 (5Km)，及新鮮度 （ 2）確定反應(yīng)條件 __溫度： 25℃ 、 37℃ 、最適溫度及其他 __pH：最適 pH（合適的緩沖液） __其他：適當(dāng)添加激活劑。 在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下 （ 如溫度 、 pH的限定和足夠的底物濃度等 ） ， 每分鐘催化 1?mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為 1個(gè)國際單位 （ IU） 。 作用于大分子的酶的絕對和相對特異性的理解：例如核酸內(nèi)切酶 人體內(nèi)有多種蛋白激酶，它們均催化底物蛋白質(zhì) 絲氨酸（或蘇氨酸）殘基上羥基的磷酸化 蛋白激酶 共有序列 蛋白激酶 A XR(R/K)X(S/T)X 蛋白激酶 C X(R/K13,X02)(S/T)(X02,R/K13)X 蛋白激酶 G X(R/K)23X(S/T)X Ca2+/鈣調(diào)素蛋白激酶 H XRXX(S/T)X （三）有些酶僅對底物分子的某種構(gòu)型起催化作用 酶對空間構(gòu)型所具有的特異性要求稱為空間異構(gòu)特異性 （ stereospecificity） 延胡索酸酶僅對延胡索酸 (反丁烯二酸 )起催化作用 ， 將其加水生成蘋果酸 ， 對順丁烯二酸則無作用 ?旋光異構(gòu)特異性： 例如 ： L乳酸脫氫酶 丙酮酸 L乳酸 D乳酸脫氫酶 丙酮酸 D乳酸 C CH3 OH COOH H C CH3 OH COOH H L(+)乳酸 D()乳酸 酵母中的酶 D型葡萄糖 發(fā)酵 酵母中的酶 L型葡萄糖 發(fā)酵 L精氨酸酶 L精氨酸 L鳥氨酸 + 尿素 D精氨酸 ?幾何異構(gòu)特異性 延胡索酸酶 反丁烯二酸 蘋果酸 延胡索酸酶 順丁烯二酸 三、 酶的可調(diào)節(jié) 性 酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體對不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動的需要。 脂肪酶不僅水解脂肪，也可水解簡單的酯。 脲酶僅水解尿素，對甲基尿素則無反應(yīng)。 （一）有的酶對其底物和反應(yīng)類型具有極其嚴(yán)格的選擇性 有的酶僅對一種特定結(jié)構(gòu)的底物起催化作用 ， 產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物 。 親電子催化 （ electrophilic catalysis） 可使酶活性中心的陽離子親電子基團(tuán)與富含電子的底物形成共價(jià)鍵 。 A?B + E： ??? A?E + B H2O A?E ??? A + E： + B 酶舉例 親核基團(tuán) 共價(jià)結(jié)合中間產(chǎn)物 絲氨酸蛋白酶 絲氨酸 ?OH ?；? 巰基酶 半胱氨酸 ?SH ?；? ATP酶 天冬氨酸 ?COO? 磷?；? 含吡哆醛的酶 賴氨酸 ?NH2 Schiff堿 磷酸甘油酸變位酶 組氨酸 磷酰基酶 谷氨酰胺合成酶 酪氨酸 ?OH 腺嘌呤酶 酶的親核基團(tuán)與底物共價(jià)結(jié)合 3． 親核催化 : 酶可通過親核催化或親電子催化加速反應(yīng) 酶活性中心有的催化基團(tuán)屬于親核基團(tuán) ， 可以提供電子給帶有部分正電荷的過渡態(tài)底物 ， 形成瞬間 共 價(jià) 鍵 。 1． 酸堿催化 ： 質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)都包含一般酶 堿催化反應(yīng) 氨基酸殘基 酸（質(zhì)子供體） 堿（質(zhì)子接受體） 谷氨酸、天冬氨酸 R?COOH R?COO? 賴氨酸、精氨酸 半胱氨酸 R?SH R?S? 組氨酸 絲氨酸 R?OH R?O? 酪氨酸 R N H H H + R NH 2 .. CH NH HN C CH R + CH N： HN C CH R OH R O R 酶分子中具有酸 堿催化作用的基團(tuán) 2． 共價(jià)催化 : 酶可與底物形成瞬時(shí)共價(jià)鍵 很多酶在催化過程中，與底物形成瞬時(shí)共價(jià)鍵，底物與酶形成共價(jià)鍵后被激活（轉(zhuǎn)變態(tài)，活化能降低），并很容易進(jìn)一步水解形成產(chǎn)物和游離的酶。 （三）酶活性中心催化基團(tuán)通過多種途徑催化產(chǎn)物的生成 酶是兩性解離的蛋白質(zhì) ， 酶活性中心上有些基團(tuán)是質(zhì)子供體 （ 酸 ） ， 有些是質(zhì)子接受體 （ 堿 ） 。 酶的活性中心多位于其分