初級分離,沉淀分離-文庫吧資料
2024-10-25 12:02本頁面
【正文】 多價金屬離子 (polyvalent metal ions) 機理： 與蛋白質(zhì)分子上某些殘基發(fā)生相互作用 62 54 各種沉淀方法應(yīng)用范圍 鹽析法： 多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。 ? 在核酸提取液中加入氯仿 戊醇，振蕩一段時間、使蛋白質(zhì)在氯仿 水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 例如對于 α 淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白受熱變性沉淀而被除去。 ? 方法： １）利用對熱的不穩(wěn)定性 ,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；２）酸堿變性。 62 50 選擇性沉淀法 ? 概念： 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。 非離子型聚合物沉淀法 優(yōu)點： A、 體系的溫度只需控制在室溫條件下； B、 沉淀的顆粒往往比較大 ， 產(chǎn)物比較容易收集； C、 PEG非但不會使 pro變性 ,而且可以提高它的穩(wěn)定性； D、 PEG無毒 ， 優(yōu)先使用在臨床產(chǎn)品的加工過程中 。 ?常用非離子性聚合物為 Polyethylene glycol (PEG)： 是一種水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉淀蛋白質(zhì)。 熱沉淀基于蛋白質(zhì)變性動力學(xué) 積分式 kD為變性速率常數(shù)，用 Arrhenius方程表示 ?用聚乙二醇等非離子性聚合物亦能降低蛋白質(zhì)的溶解度 ， 有選擇性的沉淀蛋白質(zhì) 。 熱沉淀 利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。 某些金屬離子： 一些金屬離子如 Ca2+、 Zn2+等可與某些成陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。 中性鹽濃度： 較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。 樣品濃度： 樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增加共沉作用 。 因此，所用的有機溶劑須預(yù)先冷卻到 10－ 20℃ ；在使用有機溶劑沉淀生物高分子時，整個操作過程應(yīng)在低溫下進行 。 溫度 使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行， ?有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，有機溶劑要緩緩加入，防止溶液局部升溫。 C、 pH值：在確定了 [乙醇 ]以后 ， pro最低溶解度出現(xiàn)在蛋白 .的 pI處 ， 因此可以通過調(diào)節(jié) pH值來選擇性分離蛋白質(zhì) 。 B、 [乙醇 ]：通常隨 [乙醇 ]上升 ， pro溶解度下降 。 解決辦法：攪拌 、少量多次加入 ， 以避免溫度驟然升高損失 pro活力 。 C、 丙酮 、 乙醇等不僅是 pro的沉淀淀劑 ， 而且還是一種變性劑 ，可見作用有機溶劑使 pro在沉淀和變性之間既有區(qū)別又相關(guān)聯(lián) 。 r2 B、 去水化層 有機溶劑使 pro溶劑化 ， 使原來與 pro結(jié)合的水被溶劑所取代 ， 從而降低了 pro溶解度 。 q1 有機溶劑沉淀法 有機溶劑的種類： 丙酮 (首選 )、 乙醇 、 甲醇 和乙腈 ， 常用于低鹽濃度下沉淀 pro。 有機溶劑沉淀法 同鹽析一樣 ， 隨著沉淀劑 ——有機溶機濃度的上升 ， 蛋白質(zhì)溶解度也呈指數(shù)規(guī)律下降 。為了使 pH緩慢變動，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。如明膠，則在低離子強度的溶液中，調(diào) pH在等電點并不產(chǎn)生沉淀。 62 39 等電點沉淀法 ? 細胞色素 C洗脫液（離交） + 硫酸胺（飽和度 86%） ? 調(diào) ，低溫離心 上清液調(diào) ↓ ? 沉淀（雜蛋白） 等電點沉淀法注意事項 ?本法適用于憎水性較強的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電點時能形成粗大的凝聚物。 ?超氧化物歧化酶熱穩(wěn)定性很好， 對提取 液在 60176。 等電點沉淀法 利用脂肪酶和淀粉酶的熱敏感性不同， 在 40~42176。 最大缺點：無機酸會引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險 。 在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時這種類型的沉淀更有效 。 生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào) 蛋白質(zhì)，再調(diào) 酸性蛋白質(zhì)。 200C時，硫酸銨的飽和溶解度是 761g/L（ 1L水加 761g硫酸銨），飽和溶液體積為 ，飽和濃度為 (534g/L)，定義為 100%飽和度 鹽析沉淀 20℃ ， 硫酸銨添加量計算 （ M摩爾濃度 ， S飽和度 ） 0℃ ， 硫酸銨添加量計算 25 ℃ 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 Why? P39 離子強度較高時 ， 升高溫度有利于蛋白質(zhì)失水 溶解度下降 鹽析沉淀 D、 溶液 pH pH影響 Cohn方程中的 ?值 。 鹽析沉淀 B、 無機鹽添加方式 鹽析沉淀 C、 溫度 T T影響 Cohn方程中的 ?值 。 ?次常用 Na2SO4。 對陽離子排序為： Al3+ H+ Ba2+ Ca2+ Cs+ NH4+ K+ Na+ Li+ 如何設(shè)計實驗 ？ 結(jié)論 ？ 鹽析沉淀 結(jié)論： a 不同種類的鹽主要影響 Ks； b 離子半徑小 ， 帶電多 ， 電荷密度高 ， 鹽析效果好 。 鹽析沉淀 影響因素 A、 無機鹽種類 一系列鹽沉淀蛋白質(zhì)的能力進行了測定研究 。 鹽析沉淀 ? Ks鹽析法 :由于蛋白質(zhì)對離
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1