蛋白質(zhì)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法-文庫吧資料
2025-05-21 11:46本頁面
【正文】 SPAGE ? 溴酚藍(lán)染料：用于監(jiān)控整個(gè)電泳過程。 SDSPAGE ? SDS 即十二烷基磺酸鈉（ CH3(CH2)10CH2OSO3 Na）：一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 ? 為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們?cè)谏蠘忧?，通常?huì)進(jìn)行一些處理 (上樣緩沖液 )。樣品 (樣品 BSA溶液或蛋白質(zhì)溶液 )與 PBS共 25ul（ ）加樣，最后每孔均加200ul（ 2ml）工作液（ BCA： Cu 50： 1 嫩綠色）混勻， 37 C孵育 30 min, 冷卻到室溫后，酶標(biāo)儀上 562 nm處讀數(shù)。 BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響 。 BCA與 Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在 562 nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Lorry法進(jìn)行了改良 蛋白質(zhì)定量 ? Bicinchoninic acid (BCA )法 近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。 ? Bradford法 蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán) G250結(jié)合 最大吸收峰從 465nm變?yōu)?595nm 在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液 595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比 不能含有太高濃度的去污劑，對(duì)樣品的要求較高。該混合物優(yōu)化的組成使其可以強(qiáng)烈?guī)缀跛兄匾牡鞍琢姿崦富钚?，包括蛋白絲 /蘇氨酸磷酸酶(PP PP2A、 PP2B、 PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等。 ? Western Blot和免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)、蛋白激酶活性測定，抑制磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。 ? CoIP 蛋白酶抑制劑：胃蛋白酶抑制劑 (pepstantin)、亮抑蛋白酶肽 (leupeptin)、胰蛋白酶抑制劑 (aprotinin)等；能夠強(qiáng)烈抑制所有蛋白酶的活性（如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶）。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用 蛋白酶抑制劑 。 蛋白裂解液的制備 ? 當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來或被激活。 蛋白裂解液的制備 蛋白裂解液的制備 ? RIPA Buffer： 裂解液和細(xì)胞應(yīng)充分接觸， RIPA buffer足量。 Western Blot Western Blot ? A. Sample preparation ? B. Electrophoresis ? C. Transfer of proteins and staining (Western blotting) 蛋白裂解液的制備 ? 組織樣品 ：取適量（約 100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加 1ml 含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。蛋白質(zhì)研究的基
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