核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析ok-文庫(kù)吧資料
2025-05-17 21:40本頁(yè)面
【正文】 抽提去除雜物。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放 RNA，有效抑制核酸酶。 ? 異硫氰酸胍 /苯酚法 ? 步驟 : ? 材料準(zhǔn)備： 盡量新鮮。 對(duì) 策 原因 1. 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 3. 沉淀不完全 4. 洗滌時(shí) DNA丟失 1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 2. 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 3. 高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加 PK的用量） 4. 低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間 5. 加輔助物，促進(jìn)沉淀 6. 洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題三： DNA提取量少。 核酸分離、純化 ?多酚的去除： ? 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： β 巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 ? 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如 PVP、 PEG(聚乙二醇 )，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與 DNA的結(jié)合 核酸分離、純化 ?鹽離子的去除： ? 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解 ? 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 ? 沉淀時(shí)加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀 ? 沉淀后應(yīng)用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 ? 晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥） ? 若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用 TE緩沖液溶解 ? TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase ? pH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) 2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 3. DNA中殘留有金屬離子 1. 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前） 2. 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3. 增加 70％乙醇洗滌的次數(shù)（ 23次） DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題 ?問(wèn)題一： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 第一部分： DNA提取方法簡(jiǎn)介 第二部分： DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、 原因分析及其對(duì)策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡(jiǎn)介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見(jiàn) 問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策 提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策DNA提取的基本步驟 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) 材料準(zhǔn)備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 ? 提取血液基因組 DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） ? 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加） ? 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解 ? 材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致 DNA量少，純度低 ? 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： ? 植物材料－－液氮研磨 ? 動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨 ? 組培細(xì)胞－－蛋白酶 K ? 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠 ? 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 菌體量適當(dāng) ? 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證
高考資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1