【正文】 rcellsClinCancerRes， 2021,6(3)： 924～ .銀杏外種皮與銀杏葉中黃酮含量的比較 .中草藥， 1991,22(8)： .銀杏葉藥用研究概況 .中國(guó)生化藥物雜志， 1996,71(1): ，趙勇，劉樹東等 .不同廠家銀杏葉制劑中總黃酮含量的測(cè)定 .中國(guó)新藥雜志 ,1997,6(6): .銀杏樹 24 小時(shí)內(nèi)總黃酮的含量變化 .時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2021， 13(6)： 91～ ，馬柏林 .沙棘黃酮的微乳薄層色譜分離鑒定研究 .沙棘， 2021， 13(1)： ，梁淑芳 .杜仲黃酮的微乳薄層色譜分離鑒定研究 .西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2021， 16(2)： 72～ ，陳驍鵬，董小平．高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉膠囊含量 .江蘇藥學(xué)與臨湊研究雜志 .2021,12(1)： 29～ 32． .中華人民接和國(guó)藥典．一部．北京：北京出版社，2021:281～ 282． 致謝 本論文是在趙麗老師的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文選題、方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)安排中疑難問題的解答到論文的撰寫都得到了老師的悉心指導(dǎo)。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于銀杏葉化學(xué)成分的 11 研究，只是針對(duì)總黃酮、銀杏內(nèi)酯 (A， B)、白果內(nèi)酯，而對(duì)其他化合物的研究較少，這主要是提取分離獲得的物質(zhì)數(shù)量有限，制約了進(jìn)一步對(duì)活性的研究。面對(duì) 銀杏葉中不斷涌現(xiàn)的新的化學(xué)成分，有必要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納、總結(jié)。 用薄層色譜指紋圖譜方法分析了幾批銀杏葉提取物，符合中藥指紋圖譜對(duì)薄層色譜技術(shù)的要求，且操作簡(jiǎn)單、設(shè)備易得，非常適合我國(guó)的國(guó)情。薄層色譜法在中藥分析中有以下特點(diǎn)：對(duì)被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒有限制，使用范圍廣；固定相使用一次，樣品預(yù)處理較簡(jiǎn)單；薄層具有多路柱效應(yīng)，可同時(shí)進(jìn)行每個(gè)樣品的分離，所以樣品的分析時(shí)間短；不受一種監(jiān)測(cè)器的限制，在同一色譜柱上可根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)選擇多種檢 測(cè)方法進(jìn)行定性或定量，并且可以重復(fù)測(cè)定；當(dāng)吸附劑高效化、定量分析儀器化、自動(dòng)化后，提高了薄層色譜的分辨率及重現(xiàn)性。在其他人的微乳液基礎(chǔ)上，結(jié)合黃酮的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)節(jié)微乳系統(tǒng)的極性，溫度和濕度，分離出銀杏葉提取物黃酮斑點(diǎn) 12 個(gè)。該微乳液加入 8％體積的水，可以有效防止黃酮斑點(diǎn)的拖尾?？梢约糸_斑點(diǎn)，溶于甲醇過濾后在 HPLC上精確分析。推測(cè)有可能是在提取或分析過程中，使蘆丁有所分解。色譜圖的下部，是黃酮極性大的成分，如黃酮的鹽酸鹽等。據(jù)此也可作為制訂 GBE的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。紫外燈下各批次的黃酮斑點(diǎn)顏色為亮黃色。 從色譜圖可見，銀杏葉中均含有蘆丁和槲皮素，雖然兩者的極性相差不大 (黃酮苷的結(jié)構(gòu)類似 )，但蘆丁的分子量比槲皮素大，因此蘆丁的Rf()比槲皮素的 Rf()較小。由色譜指紋圖譜可見，銀杏黃酮能被此微乳系統(tǒng)完全分離。 銀杏葉黃酮的分離，以含水量 67％ 的微乳體系 甲酸 (92： 8)為展開劑，聚酰胺薄層板為固定相。 此外，展開板的種類、濕度、溫度等均對(duì)銀杏黃酮的分離有影響。 飽和度對(duì)展開效果的影響 展開劑置入展開缸中，實(shí)驗(yàn)必須封閉飽和。而強(qiáng)酸易造成黃酮苷類分解，因此選擇弱酸：甲酸調(diào)節(jié)酸度。 酸度對(duì)展開效果的影響 由于黃酮中酚羥基的存在，使其略顯酸性。在含水量為 70％時(shí)，雖然斑點(diǎn)較多，但有少量拖尾，不能有效分離。 微乳液含水量與斑點(diǎn)形態(tài)的關(guān)系如表 11所示。實(shí)驗(yàn)室樣品 GBE 在微乳液含水量較高時(shí)的砒值比對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所高。均勻噴灑 1％氯化鋁乙醇溶液，烘干，于 365nm紫外燈下觀察。 用定量毛細(xì)管吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照標(biāo)液、 GBE 樣品液于聚酰胺膜上點(diǎn)樣，直徑約 1mm，吹干。 稱取蘆丁，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成 1mg/mL 甲醇溶液，作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液。 GBE液 取不同批次的銀杏葉，剪碎后用甲醇提取，收集甲醇提取液、干燥后為棕黃色粉末。 微乳液系統(tǒng)的配制 按照十二烷基硫酸鈉 (SDS)：正丁醇：正庚烷 =： ： (重量比 )稱取各試劑，加少量水制成微乳液。本實(shí)驗(yàn)用甲苯、醋酸乙酯和吡啶以不同比例作為展開劑，都僅能展開兩三個(gè)點(diǎn)。 銀杏葉， 2021年購(gòu)于甘肅南鄰地區(qū)。 62 實(shí)驗(yàn)部分 2． 1銀杏葉中黃酮類化合物的含量測(cè)定 器與藥品 薄層色譜紫外分析儀 (天津市琛航科技儀器有限公司 )、自動(dòng)點(diǎn)樣儀 (天津市琛航科技儀器有限公司 )、定量毛細(xì)管 (天津市琛航科技儀器有限公司 )、雙槽展開缸 (重慶玻璃儀器廠 )、電吹風(fēng)、聚酰胺預(yù)制板 (臺(tái)州四青生化材料廠 )、新型噴霧瓶 (華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠 )，十二烷基硫酸鈉 (SDS)、正丁醇、正庚烷、三氯化鋁、乙醇均為分析純。鑒于這種情況應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)銀杏葉制劑的研發(fā)工作，充分利用我國(guó)得天獨(dú)厚的銀杏樹資源，采用先進(jìn)、可靠、規(guī)范的檢測(cè)方法，對(duì)我國(guó)各地銀杏葉資源的品位加以評(píng)定，以期合理使用；大力開展其工藝研究，為提高產(chǎn)品質(zhì)量不懈地進(jìn)行工藝改進(jìn)，使劑型多樣化，爭(zhēng)取出口；為開拓國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，應(yīng)加大臨床研究的進(jìn)度，為推廣應(yīng)用創(chuàng)造條件；要開拓銀杏葉提取物的用途， 例如飲料、清涼口服液、復(fù)方制劑和化妝品等，其提取物十分穩(wěn)定，不需要加乙醇或表面活性劑。丁青龍等 [17]曾對(duì)國(guó)內(nèi)不同廠家的制劑進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定，黃酮含量基本合格，但內(nèi)酯含量不足，故國(guó)內(nèi)銀杏葉制劑的質(zhì)量有待提高。銀杏葉的各種提取物、各種制劑以及營(yíng)養(yǎng)品等都要有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化，才能控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。 1990 年上海天工植物制品廠出品的銀杏葉干浸膏已銷往歐洲； 1990 年西安國(guó)藥廠與沈陽(yáng)藥學(xué)院共同研制的出口用銀杏 葉標(biāo)準(zhǔn)提取物，其質(zhì)量與法國(guó)HawaiianAgronomicsSA 公司的標(biāo)準(zhǔn)相一致； 1991 年湖南醫(yī)工所與寧遠(yuǎn)縣天然植物提煉廠合作研制，總黃酮含量按出口標(biāo)準(zhǔn)分別為 16%及 24%2種規(guī)格，收率為 2%～ 3%，已初步形成生產(chǎn)規(guī)模；上海藥物所與康恩貝制藥公司用銀杏葉開發(fā)的制劑天保寧已上市，臨床用作冠脈循環(huán)改善劑；國(guó)家“七五”中醫(yī)藥攻關(guān)項(xiàng)目銀杏口服液于 1992 年在遵化制藥廠投產(chǎn)?，F(xiàn)分離出的二萜內(nèi)酯有銀杏苦內(nèi)酯 A,B,C,M等 4 種，其中銀杏苦內(nèi)酯 B(BN520210)的抗 PAF活性最強(qiáng)；倍 5 半萜內(nèi)酯為白果內(nèi)酯 (Bilobalide)。此外尚有兒茶素類化合物 4 種。其中單黃酮類主要為山奈酚 (Kaempferol)和槲皮素 (Quercetin)的單、雙和三糖甙化合物，糖元多為葡萄糖和鼠李糖；其他尚有異鼠李素(Isorhamin)、楊梅黃素及蕓香甙等。 1． 3 銀杏葉的化學(xué)成分 黃酮類化合物是銀杏葉的主要藥用成分，其黃酮含量在很大程度上決定著銀杏葉的利用價(jià)值。但實(shí)際上，它對(duì)疾病的治療作用還遠(yuǎn)不止于此。魏恩會(huì)等觀察銀杏內(nèi)酯 B 對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是否用血管緊張素 II 誘導(dǎo)， GB 與銀杏內(nèi)酯 A 和 B的混合物均呈濃度依賴性地抑制SMC(主動(dòng)脈平滑肌 )的增殖，其機(jī)制與阻止細(xì)胞有絲分裂期有關(guān)，說明GB 可抑制動(dòng)脈壁 SMC 的增殖，該作用不完全取決于血小板活化因子受體的拮抗活性。鄰近受損的內(nèi)皮細(xì)胞和進(jìn)入內(nèi)皮下層的吞噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些生物活性物質(zhì)可促進(jìn)中層的 VSMC 向內(nèi)膜下遷移并過度增殖，同時(shí)分泌很多活性物質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致血管重構(gòu)，一旦 VSMC的增殖超過盤管的代償能力，會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚和血管腔變窄，最終引發(fā)急性心、腦血管病。另外還可以 使處于異常狀態(tài)下的血管功能恢復(fù)正常水平[13]。黃酮類化合物還可降低血管 4 內(nèi)皮細(xì)胞羥脯酸代謝，使內(nèi)壁的膠原或膠原纖維含量相對(duì)減少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治動(dòng)脈粥樣硬化 [11]。 血小板黏在一起，能使血凝塊的形成，而血凝塊會(huì)導(dǎo)致心臟病發(fā)作或中風(fēng)，如果通往心臟的動(dòng)脈里有血凝塊，就會(huì)造成心臟病發(fā)作；如果血凝塊停留在通往腦部的動(dòng)脈里，就會(huì)造成中風(fēng)。在我國(guó)急性心肌梗死同樣也是一個(gè)引起關(guān)注健康問題，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，心肌梗死患病率在我國(guó)平均為 1／ 100000，死亡率為患病率的 10％。 冠心病是由于心肌的嚴(yán)重缺血而引起心肌的損傷和壞死，而急性心肌梗死是其臨床的主要表現(xiàn)。 因此，銀杏葉提取物具有調(diào)節(jié)血脂，抑制血小板聚集，擴(kuò)張腦血管，清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等，保護(hù)腦組織免受缺血缺氧的損害。其中，對(duì)銀杏葉提取物，在臨床也取得了肯定療效。對(duì)于此類疾病，目前最重要的防治手段是提倡使用神經(jīng)保護(hù)劑。 目前，以腦梗死為代表的腦缺血性疾病已上升為人類第三大致死原因，成為倍受矚目的常見多發(fā)病。通俗的解釋，銀杏能保護(hù)動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管免受傷害，并增強(qiáng)強(qiáng)度和彈性。彭洪 [9]采用水蒸氣蒸餾及 GC／ MS 分析鑒定出銀杏揮發(fā)油 17 種化學(xué)成分；周維書 [10]按中國(guó)藥典法提取了揮發(fā)油并分析出 35種化學(xué)成分。 1． 2 銀杏葉的作用 銀杏葉能夠抗衰老，消除人體自由基，改善血流量，增加腦供血。 [3]”銀杏葉的研究始于本世紀(jì) 60 年代，由于發(fā)現(xiàn)其具有抑制血小板活化因子的作用，能夠改善心血管系統(tǒng)的滲透性、彈性及血液流變速度，對(duì) 機(jī)體組織具有抗缺氧的能力，故引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的關(guān)注。銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，又名白果葉。 關(guān)鍵詞：銀杏葉黃酮含量薄層色譜生長(zhǎng)時(shí)期高效 液相色譜 Title： InGingkoleafflavonoidcontentdetermination Liujiangnan DrugqualitytestingtechnologyAbstract ：Flavonoidsarethemainmedicinalponentsofginkgobiloba,itsflavonoidcontenttoalargeextentdeterminesthevalueofginkgobilobau(SDS)1butanol1heptanemicroemulsionsystemofwaterasthemobilephase,prepolyamidethinlayerplateasthestationaryphase,byadjustingthepolarityofthemicroemulsionsystem,tionalsystemtheanicsolutionsystems,themicroemulsionsystegrowthandflavonoidscontentduringtheparison,analysisofflavonoidsofGinkgobilobainthevariationwithgrowthphase,revealingtdthat:differentgrowthstagesofthecontentofflavonoidsinasignificantreductionin1yearintheflavonoidcontentof2timesthe 1peak,inAugustthefirstonepeakappears,4%,thendecreasedrapidlyinOctoberleavesyellowcolorafterrising%.KeyWords ：Ginkgobiloba,Flavonoidscontent,TLC,Growthperiod,HPLC . 21 前言 1． 1 銀杏葉的介紹 銀杏 (Ginkgobilobal，又名公孫樹，白果 )系裸子植物門銀杏科 植物，有“活化石”之稱，是當(dāng)今地球上最古老的樹種之一，為我國(guó)特產(chǎn)，我國(guó)銀杏資源擁有量占世界總量的 75％左右，占世界首位 [1,2]。通過對(duì)大齡銀杏葉不同生長(zhǎng)時(shí)期黃酮含量的測(cè)定與比較，分析銀杏葉中黃酮含量隨生長(zhǎng)期的變化規(guī)律，揭示出大齡銀杏樹采摘葉片的最佳時(shí)期。以十二烷基硫酸鈉 (SDS)一正丁醇一正庚烷一水微乳系統(tǒng)為流動(dòng) 相，預(yù)制聚酰胺薄層板為固定相，通過調(diào)節(jié)微乳系統(tǒng)的極性，較好地分離出十幾種銀杏葉黃酮。 在論文完成過程中得到了同事蘇州職業(yè)大學(xué)尤神龍的關(guān)心、指導(dǎo)和幫助，在此表示由衷的感謝。對(duì)學(xué)生無私的教誨，使我受益匪淺，終生難忘。幾個(gè)月來，指導(dǎo)導(dǎo)師給予我無微不至的指導(dǎo)和關(guān)懷。如果能在活性方面 作深入的研究，開展構(gòu)效關(guān)系的分析，可以更有效地促進(jìn)銀杏葉的開發(fā)和利用。銀杏葉及其提取物用于治療心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中銀杏葉黃酮、萜內(nèi)酯和聚異戊烯醇是主要的藥效成分，具有顯著的療效，且無明顯副作用。為銀杏葉藥材的標(biāo)準(zhǔn)化種植，銀杏葉提取物及其制劑的質(zhì)量控制提供了簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)可靠的方法 3 對(duì)銀杏葉發(fā)展的展 望 當(dāng)今國(guó)內(nèi)外對(duì)于銀杏葉的化學(xué)成分的研究很多，各國(guó)科學(xué)家已經(jīng)從銀杏葉中分離鑒定出很多成分，并從中發(fā)現(xiàn)了重要的活性成分。因此氣相色譜法和高效色譜法不能代替薄層色譜法。改善了 GBE 的薄層色譜分離技術(shù)，為平面色譜在中藥鑒定和色譜分析中的應(yīng)用展示了良好的前景。梁淑芳等用微乳體系分離沙棘黃酮得 8 個(gè)斑點(diǎn) [19]，馬柏林等也用此方法分離杜仲黃酮得 9 個(gè)斑點(diǎn) [20]。 由十二烷基硫酸鈉 — 正庚烷 — 正丁醇以 ： ： 的比例溶于67％的水中組 成的微乳體系，適合于分離銀杏葉黃酮。上部是比槲皮素極性更小的黃酮，如二氫黃酮及其化合物等。中部為槲皮素和蘆丁，槲皮素是蘆丁的一種分解產(chǎn)物。 ； 2．蘆丁對(duì)照品； 3．中國(guó)藥品生物制品檢定所提供GBE 樣品； 4． GBE 樣品 A； 5． GBE 樣品 B； 6． GBE 樣品 C； 7． GBE 樣品 D 圖 12 各批銀杏葉薄