【正文】 過 75％，由于脂溶性物質(zhì)的溶出顯著增加，會給提純帶來麻煩。 提取劑濃度的影響 實驗過程中選取乙醇提取濃度分別為 65%、 75%、 80%、 85%、 95%，提取條件保持 ，在 80℃ 下，回流提取時間為 ，料液比為 1:20，結(jié)果見表 33。 其中乙醇具有溶解性能好，對植物細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)的優(yōu)點，除了蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多數(shù)有機(jī)化合物都能在 乙醉中溶解；乙醇雖然易燃，但毒性小、價格便宜、來源方便、沸點適中，也可回收反復(fù)使用，本身還具有殺菌作用，不易發(fā)霉變質(zhì)。堿性水溶液的提取效果略好，但是提取液顏色偏灰色，雜質(zhì)較經(jīng)石油醚脫色，提取效率與沸水相比提取并不多。 本實驗中選取沸水、 PH=9的堿性水溶液、 75％乙醇溶液、 75％甲醇溶液、 75％丙酮溶液實驗結(jié)果如圖 32。 (2) 溶耕不能與植物成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，即使反應(yīng)亦屬于可逆性的。 單因素實驗結(jié)果 提取劑的影響 通常按極性化合物易溶于極性溶劑，非極性化合物易溶于非極性溶劑，同類分子或官能團(tuán)相似的彼此互溶的一般規(guī)律來選擇，溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。 M(%)=[Y(100/10)(50/2)10106100]/w。其結(jié)果見表 31 表 31 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測定結(jié)果 V 蘆丁溶液（ mL） C 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（ μg/mL） 吸光度 A 1 0 0 2 1 3 2 4 3 5 4 6 5 7 6 由上表，以吸光度值 —— 蘆丁濃度作圖得， 圖 31蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖 01020304050607080蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度/μm/mL吸光度 A 22 用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度 C與吸光度 A的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式： C=，相關(guān)系數(shù) R2= 黃酮含量及提取率 黃酮總含量的測定應(yīng)用索氏提取器，測定 3 次，求的平均含量。 21 第 3章 結(jié)果與討論 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 本實驗過程中，黃酮類化合物檢測以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，應(yīng)用 亞硝酸鈉 硝酸鋁顯色法 ，通過測定吸光度來確定黃酮類物質(zhì)的含量。 (4) 脫色除脂過程中，要待分層結(jié)束，醚層上部出現(xiàn)澄清液時，再分液。 (2) 提取過程中，保持提取溫度穩(wěn)定，一定不能使溶劑揮發(fā)。 表 23 單因素實驗條件表 乙醇濃度 提取溫度 料液比 提取時間 恒溫水浴 80℃ 75%濃度乙醇 75%濃度乙醇 75%濃度乙醇 提取時間 提取時間 提取時間 恒溫水浴 80℃ 料液比 1:20g:ml 料液比 1:20g:ml 恒溫水浴 80℃ 料液比 1:20g:ml 1 65% 60℃ 1:10 2 75% 70℃ 1:20 3 80% 80℃ 1:25 4 85% 90℃ 1:30 5 95% 60℃ 1:35 6. 正交試驗確定提取的最佳條件 為了全面考查影響因素，設(shè)計了 4 因素 3 水平的正交試驗，試驗因素水平見表 24， L9(34)正交表見表 25。 (4) 提取時間對浸提效果的影響 分別采用 、 、 、 、 3的操作步驟進(jìn)行試驗，以濃度為75%的乙醇為提取劑，提取溫度為 80℃ ， 料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取時間對提取效果的影響。 (2) 提取溫度對浸提效果的影響 分別采用 50℃ 、 60℃ 、 70℃ 、 80℃ 、 90℃ 、的提取溫度 [16]按 3的操作步驟進(jìn)行試驗，以 19 濃度為 75%的乙醇為提取劑，回流提取時間為 ，料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取溫度對提取效果的影響。 4. 提取溶劑的選擇 分別用沸水、堿性水溶液 (pH值 )、 75％乙醇溶液、 75％甲醇溶液、 75％丙酮溶液 [16]，80℃ 水浴下，回流浸提 ，料液比為 1:20分別提取，測定其吸光度，計算其提取率分別。提取率 (%)=(提取黃酮含量 /決明子中總黃酮的平均含量 )100[18]。重復(fù) 3次，結(jié)果取平均值 [18]。加水于 100mL容量瓶中定容，作為待測液 [17]。 2. 決明子中黃酮平均含量的提取及測定 決明子中總黃酮平均含量的測定。 圖 21 黃酮提取實驗流程 實驗所用儀器裝置見 圖 22.、 23 吸光度 A中藥決明子測定吸光度黃酮水溶液 2加入顯色劑30 %乙醇黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液脫色除脂加入石油醚黃酮水溶液 1蒸餾回收乙醇提取液乙醇回流提取粉碎決明子粉末 17 測量設(shè)定數(shù)顯恒溫水浴鍋 圖 22 提取裝置 圖 23 蒸餾裝置 18 實驗方案 1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將蘆丁于 120℃ 下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品 ，用 30％乙醇溶解，定溶于 100mL，得濃度為 。9H2O 天津永晟精細(xì)化工有限公司 氫氧化鈉 NaOH 天津永晟精細(xì)化工有限公司。 儀器與藥品 實驗儀器 表 21 實驗儀器 名稱 型號 生產(chǎn)廠家 循環(huán)水式多用真空泵 SHB—Ⅲ 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 HHS—2S 上海市南陽儀器有限公司 可見分光光度計 722N 上海精科電子有限公司 調(diào)溫電加熱套 DZHW 河北省黃驊市中興儀器有限公司 電子天平 AW220 慈溪市天東衡器廠 大功率粉碎機(jī) QE—100 武漢縣工具有限公司 索氏提取器 天津北辰區(qū)光明儀器廠 蒸餾裝置 M22 型中量 天津玻璃儀器廠 電熱干燥箱 202—3 北京金北德工貿(mào)有限公司 實驗藥品 選用決明子在北吉大藥房購得，產(chǎn)地為廣西省。黃酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等強(qiáng)極性的溶劑中；難溶于或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。黃酮類苷元分子中引入的羥基越多，其溶解度越大。 (8) 進(jìn)行正交實驗確定最佳提取條件。 (6) 提取時間對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 14 (4) 乙醇濃度對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (2) 決明子中黃酮總含量的測定。 重點 研究不同提取條件對 黃酮提取效率的影響，確定其影響程度的大小，尋找最佳提取工藝條件。 (2) 紫外法 采用標(biāo)準(zhǔn)品與提取液在紫外區(qū)掃描，確定最大吸收波長，制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總黃酮含量 (3) HPLC 法 在銀杏 、花生殼的 黃酮定量中，由于黃酮苷較多，多采用酸水解成苷元，在 測 定總黃酮的方法中，大多采用榭皮素作對照品，也有用懈皮素、山奈酚和異鼠李素三種作為對照品。 兩種方法機(jī)理不同，亞硝酸鈉 硝酸鋁顯色原理文獻(xiàn) 認(rèn)為是蘆丁 NaNO2Al(NO3)3NaOH試劑在蘆丁 B環(huán)的 3’,4鄰二酚羥基部位反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)。通常采用的顯色方法有以下兩種 [16]： 亞硝酸鈉 硝酸鋁顯 色法 以蘆丁為標(biāo)樣，將一定量提取液置 25mL比色管中，用 30％ (v/v)乙醇補(bǔ)充至 ，加入 ％ NaNO2，搖勻，靜止 5min后加入 ％ Al(NO3)3， 6min后再加入 5mL4％ NaOH，搖勻，用 30％ (v/v)L醇稀釋至刻度， 10rain后于 510nm進(jìn)行比色。缺點是超臨界提取所需設(shè)備價格昂貴、生產(chǎn)成本高、提取物中烷基酚含量較高、對極性大的物質(zhì)提取不理想。與其它工藝相比較，該技術(shù) 具有提取率高、無殘留溶劑、無污染，活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞而保持天然特征，此技術(shù)為中草藥有效成分的熱敏性物質(zhì)的提取研究開辟一條新路。原理是沒能夠充分破壞以纖維索為主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞間相連的果膠，使植物中的果膠完全能夠分解成小分子物質(zhì)，減小提取的傳質(zhì)阻力，是植物中的黃酮 類物質(zhì)能夠充分地釋放出來。浸出過程中中藥材細(xì)粉不凝聚、不襁化，克服了熱水法易凝聚、糊化的不足。 (4) 微波法 微波技術(shù)在中草藥的應(yīng)用上越來越廣泛，原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒 24． 5億次超高頻率的快速震動，使藥材內(nèi)分子問相互碰撞、擠壓，有利于藥材有效成分的浸出。一般來說，乙醇的濃度增高有利于總黃酮的提取，但也不是絕對的，有時還與黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，高濃度的乙醇適用于提取黃酮苷元類，的濃度乙醇適用于提取黃酮苷類。常見的可以分為三種方法：冷浸法、滲漉法、回流法。有機(jī)溶劑主要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。一般可以根據(jù)不同的原料使用不同堿性溶液。氫氧化鈉水溶 液的浸出能力高，但雜質(zhì)較多不利于純化。 (2) 堿性水或堿性稀醇提取法 黃酮類物質(zhì)大多具有酚羥基，因此可以用堿水或堿性稀醇浸出，經(jīng)酸化后得出黃酮類物質(zhì)。此工藝成本低、安全、設(shè)備簡單，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，但是用水提取時，提取中雜質(zhì)較多 (如無機(jī)鹽、蛋自質(zhì)、糖類等 )，后續(xù)分離麻煩。生物酶法提取植物中黃酮的提取效果好、提取率高，已被廣泛應(yīng)用 15。目前，對苷類和極性較大的苷元，常用某些極性較大的混合溶劑 (如甲醇～水 (1： 1)、水、甲醇、乙醇、丙酮進(jìn)行提取，而對大多數(shù)苷元則采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性小的溶劑進(jìn)行提取。從加工過程看主要有兩種形式，一種是用富含黃酮類的原料直接加工成食品，在加工過程中最大程度地保留有效成分；另一種是從原料中提取出黃酮類物質(zhì)，再把他添加到其他原料中進(jìn)行加工制成產(chǎn)品。 (8) 黃酮類化合物在食品方面的應(yīng)用 除了作為藥物使用以外，在食品工業(yè)上，也把它作為功能食品的添加劑、天然抗氧化劑、天然色素和天然甜味劑等等。其作用機(jī)制與清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對抗四氧嘧啶所致的 β 細(xì)胞損傷促進(jìn) β 細(xì)胞修復(fù)和再生密切相關(guān)。它們可顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖和血清膽固醇水平，降低胰島的 MDA水平，升高 血和胰島的谷光甘肽 (GSH)水平。近來研究顯示， BAI還具有抗艾滋病病毒 HIV的作用，能誘導(dǎo)感染 HIV的細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明， BAI對多種革蘭染色陽性菌、革蘭染色陰性菌及螺旋體等均有抑制作用。這方面進(jìn)行的研究較多，如銀杏黃酮、槲皮素 、桑色素、山奈酚和楊梅黃酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用。 (5) 免疫調(diào)節(jié)作用 黃酮類化合物能增強(qiáng)機(jī)體的非特異免疫功能和體液免疫功能，其通過對巨噬細(xì)胞、 T淋巴細(xì)胞、 B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞 NK、 LAK細(xì)胞、細(xì)胞因子以及影響胸腺來進(jìn) j亍免疫調(diào)節(jié)作用。甲基黃酮醇胺鹽酸赫 MFA前期研究表明： MFA有抗實驗性心率失常、實驗性心肌梗塞和實驗性血栓形成的作用，可以抑制鉀鈣引起的兔主動脈條及平滑肌收縮。例如，葛根總黃酮能擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠狀流量、降低心肌耗氧量、改善急性缺血心肌側(cè)支循環(huán)啡 [13]。方式之一是通過直接殺滅腫瘤細(xì)胞、阻止其分裂繁殖而達(dá)到抗腫瘤抗癌的作用 ；第二種抗腫瘤方式是通過增強(qiáng)其他物質(zhì)的活性間接殺死腫瘤細(xì)胞；第三種方式主要是指能減小甚至消除一些化學(xué)致癌物的致癌毒性。自由基在體內(nèi)可直接或間接地發(fā)揮強(qiáng)氧化劑作用而與機(jī)體內(nèi)核酸、核蛋白和脂肪酸相結(jié)合，轉(zhuǎn)變成氧化物或過氧化物使之喪失活性或變性，細(xì)胞功能發(fā)生障礙，引起機(jī)體逐漸衰老或病變已有實驗證明多種黃酮類化合物具有抗衰老的作用，如茶多酚、木犀草素、蘆丁等。 關(guān)于衰老機(jī)理的自由基學(xué)說認(rèn)為 [12]，機(jī)體內(nèi)的自由基可在細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生，也可由環(huán)境因素促成。 (1) 抗氧化作用 食物中豐富的黃酮類物質(zhì)發(fā)揮強(qiáng)氧化作用，其作用是通過抑制和清除自由基和活性氧來避免氧化損傷，其抗衰老的作用機(jī)制主要與抗氧化作用有關(guān)。黃酮類化合物的研究發(fā)展很快， 1950年發(fā)現(xiàn) 104種 (甙類除外 )， 1962年累計達(dá)到 201種， 1965年近 400種， 1973年約為 750種， 1965年至 1973年的八年時間，就發(fā)現(xiàn)了新黃酮化合物約為 350種 (不包括甙類 )。 圖 12 C6C3C6結(jié) 構(gòu) 根據(jù)三碳鏈的氧化程度、 B環(huán) (苯基 )連接位置 (2— 或 3— 位 )以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點，可將重要的天然黃酮化合物分類如表 11所示。 9 圖 11 2苯基色原酮 (黃酮 ) 目前黃酮類化合物其基本骨架具有 C6C3C6的特點，即由兩個芳香環(huán) A和 B，通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物。利用分子中的酚羥基和 Y一毗喃環(huán)的性質(zhì)，黃酮 類化合物具有一些特征的顯色反應(yīng) H1：鹽酸 鎂粉反應(yīng)，鈉汞齊還原反應(yīng)等還原顯色反應(yīng)，與金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)，與堿的反應(yīng)等，其中有些反應(yīng)可以作為其鑒定反應(yīng)。一般游離甙元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑及稀堿液中。 黃酮類化合物的性質(zhì) 黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)為無定形粉末。小決明油中還含有少量錦癸酸 (malvalicaeid)，及菜子甾酵 (campester01)。 據(jù)報道 [11]，大決明種子含油脂 ％～ ％，其中主要成分為軟脂酸、硬脂酸、油酸和亞油酸。 (4) 其他物質(zhì) 據(jù)分 析，每 100g可食用部分的決明子含胡蘿卜素 、核黃素 、抗壞血酸105mg。大決明中還有決明蒽酮 (torosachryone)、異決明內(nèi)酯 (isororalacto