【正文】 一個未知結構的最后確定尚有待于與合成品進行比較。 ?3．分子式的測定 經典方法是進行元素定性分析，再測定各元素的百分含量，求出實驗式，并根據分子量，推出分子式；目前最精確的方法是質譜法或高分辨質譜（ HRMS）。 87 ?2．物理常數測定 常用物理常數包括熔點、沸點、折光率、相對密度、比旋度等。最好選用兩種以上溶劑系統(tǒng)或色譜條件，采用正相和反相色譜同時進行檢驗，以確保結論的正確性。一般步驟如下： 86 1．有效成分純度的判斷 獲得單體成分是鑒定和測定結構的前提。一般通過化學、物理常數及光譜鑒定，有針對性的查對文獻，初步確定是已知物還是未知物，如果通過一定的依據判斷其可能為已知物，最好用對照品同時進行熔點、色譜和紅外光譜對照來判定試樣與對照品是否為同一化合物。 ?4．中藥在臨床治療上經常表現(xiàn)出多方面的活性，研究者應力求找出其中最本質的作用，選擇建立適宜的活性測試體系，才有可能追蹤分離出目的活性成分甚至有效成分。由于人和動物的異種差異及動物的個體差異，病理模型難以建立，使得活性篩選方法不太適宜。如附子水煎劑中的 Ca2+與微量的烏頭堿共同存在時，有明顯的強心作用，而單一 Ca2+和單一烏頭堿均無強心作用，說明兩者在強心作用上是協(xié)同完成的。 ?2．中藥對某種活性成分的表現(xiàn)，有可能不是由一種成分所產生，而是由多種成分相互協(xié)同表現(xiàn)出來的。 82 83 （三）篩選時注意事項 ?1．確保供試材料具有活性 這是活性成分篩選的前提。將乙醇不溶物重結晶后，得到番瀉苷 A，其瀉下作用較乙醇不溶物更強。 78 79 每組用大白鼠 10只分別按不同劑量喂食，觀察其瀉下情況，結果 (表 123)表明：大黃水提取物瀉下作用最強，所以水提取物是大黃瀉下作用的活性主要部分 。有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經的功效。但此方法只是以活性為指標進行追蹤，可大大減少分離的盲目性，且微量成分不易遺漏，現(xiàn)多采用這種方法進行活性成分研究。 76 另一種是將提取分離的每一階段的組分進行活性評估，追蹤其活性最強部分，再繼續(xù)追蹤，結合藥理試驗篩選，直到活性單體成分的得到。篩選方法有兩種：一種是在提取分離得到單體后再進行活性測試，即對每一個單體成分進行多個生物活性試驗指標的觀察。各類成分的常用色譜預試條件見表 122。 73 （五）色譜預試 色譜預試不僅可以減少成分間的相互干擾，還可以根據展開劑和各成分的比移值 Rf，推斷各成分的極性大小和溶解性能。 72 ?（ 3）判斷分析各反應結果時，應綜合考慮，例如異羥肟酸鐵反應為陽性的有酯、內酯、香豆素類等化合物，要配合香豆素的特有反應，將香豆素與其它酯類化合物進行區(qū)別。 ?（ 2）預試驗反應完成后，首先對反應結果明顯的成分進行分析判斷，作出初步結論。 ? （ 2）普魯士藍反應：取 1g樣品，檢前搗碎，置于試管中，加蒸餾水使?jié)駶?，立即用濾紙將試管口包緊，并在濾紙上加 1滴 10％氫氧化鉀溶液，于 50～ 60℃ 水浴中加熱 15～ 30分鐘，再在濾紙上分別滴加 10％硫酸亞鐵試劑、 10％鹽酸、 5％三氯化鐵試劑各 1滴，如濾紙顯藍色，表明可能含有氰苷。 ?2）香草醛 濃硫酸反應：取供試液點于硅膠色譜板上，揮去石油醚，噴灑香草醛 濃硫酸試劑，如產生紅、藍、紫等顏色，表明可能含有揮發(fā)油、萜類和甾醇。 （ 1）甾體、三萜類：同醇溶性成分甲項檢識 。 ? 5）熒光反應：取供試液，點于濾紙片上或硅膠色譜板上，干燥后置紫外燈下觀察，如呈現(xiàn)藍 綠色熒光，再噴灑 1％氫氧化鉀試劑，熒光加強，表明可能含有香豆素類化合物。 ? 4）間硝基苯反應：取供試液點于濾紙片上，噴灑 2％間硝基苯試劑，待乙醇揮發(fā)后，再噴灑 氫氧化鉀溶液，置 70～ 100℃ 的恒溫箱中加熱，如呈紫紅色，表明可能含有內酯類化合物。 ?2）開環(huán) 閉環(huán)反應：取 1ml供試液于試管中，加 2～ 3滴 1％氫氧化鈉溶液，于沸水浴上加熱3～ 4分鐘，得澄清溶液，再加 3～ 5滴 2％鹽酸使溶液酸化，如溶液變?yōu)榛鞚?，表明可能含有內酯類化合物? ? 本實驗也可取強心苷固體樣品少許，加入 1ml呫噸氫醇試劑振搖，置水浴上加熱 3分鐘，如呈現(xiàn)紅色，表明可能含有 2， 6二去氧糖。 65 ? 3）冰醋酸 三氯化鐵反應：取 1ml供試液于蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，殘留物加 三氯化鐵試劑溶解后，置于試管內，沿管壁加入 1ml濃硫酸，使分成二層，如上層為藍綠色，界面處為紫色或紅色環(huán)，表明可能含有 2， 6二去氧糖的強心苷類。 64 丙項檢識 （ 1） 強心苷類 ?1）堿性苦味酸反應：取 1ml供試液于試管中，加數滴堿性苦味酸試劑，如溶液即刻或 15分鐘內顯紅色或橙紅色，表明可能含有強心苷類。 ? 3）碘 碘化鉀反應：取 1ml供試液于試管中，加 2～ 3滴碘 碘化鉀試劑，如產生褐色或暗褐色沉淀，表明可能含有生物堿。 63 乙項檢識 （ 1） 生物堿類 ? 1）碘化鉍鉀反應：取 1ml供試液于試管中，加 1～ 2滴碘化鉍鉀試劑，如立即有棕黃色至棕紅色沉淀產生，表明可能含有生物堿。加熱至 100℃ 才顯紅色、紅紫色，表明含有三萜類成分。如溶液最終呈現(xiàn)紅或紫色，表明含有三萜類成分。 ?2）醋酸鎂反應：取 1ml供試液于試管中，加數滴 1％醋酸鎂甲醇溶液，如溶液呈橙紅色、紫色等顏色，表明可能含有蒽醌類。 ? 3）氨熏反應：取供試液滴于濾紙片上或硅膠色譜板上，置氨氣中熏片刻，斑點呈亮黃色，在紫外燈下觀察，斑點呈黃色熒光，表明可能含有黃酮類。 60 甲項檢識 （ 1） 鞣質類 ：同水溶性成分檢識 （ 2） 有機酸類 ：同水溶性成分檢識 （ 3） 黃酮類 ? 1）鹽酸 鎂粉反應：取 1ml供試液于試管中，加鎂粉適量，搖勻，加 2～ 5滴濃鹽酸，即產生劇烈反應，如溶液呈紅色或紫紅色，表明可能含有黃酮類。酸水不溶部分，加 10ml醋酸乙酯溶解，醋酸乙酯液用 5％氫氧化鈉溶液振搖洗滌 2次（每次2～ 3ml），棄去堿水層。濾液回收乙醇至無醇味，取 1/2量濃縮液，加 10ml乙醇溶解，供甲項檢識。本實驗也可在試管中進行。 58 （ 5）皂苷類 ?1）泡沫反應：取 2ml供試液于試管中，劇烈振搖 2分鐘，如產生大量持久性泡沫，再把溶液加熱至沸或加入乙醇，再振搖，如仍能產生多量持久性泡沫，表明可能含有皂苷。 ?2）溴酚藍反應：取供試液點于濾紙片上，噴灑 ％溴酚藍試劑的 70％乙醇溶液，如在藍色背景上產生黃色斑點，表明可能含有有機酸。 ?5）咖啡堿反應：取 1ml供試液于試管中，加入數滴 ％咖啡堿溶液，如產生棕色沉淀，表明可能含有鞣質。 56 ?3）香草醛 鹽酸反應：取供試液點于濾紙片上，干燥后，噴灑香草醛 鹽酸試劑，如立即呈不同程度的紅色，表明含有間苯二酚和間苯三酚結構的化合物。噴試劑后應立即觀察，若放置一段時間，背景也能逐漸呈藍色。 55 （ 3）酚類、鞣質類化合物 ?1）三氯化鐵反應：取 1ml供試液于試管中，加醋酸酸化后，加數滴 1％三氯化鐵試劑，溶液如呈顯綠、藍綠、藍黑或紫色，表明可能含有酚性成分或鞣質。 ? 2）雙縮脲反應：取 1ml供試液于試管中，加 1滴 10％氫氧化鈉試劑，搖勻，再加 ％硫酸銅溶液，邊加邊搖勻，如溶液呈現(xiàn)紫色、紅紫色或藍紫色，表明可能含有多肽或蛋白質。 將上述溶液中沉淀濾過除去，濾液加 1ml 10％鹽酸溶液，置沸水浴中加熱水解數分鐘，放冷后，滴加 10％氫氧化鈉溶液調 pH至中性，重復上述斐林反應，如仍產生磚紅色氧化亞銅沉淀，表明可能含有多糖或苷類。如在兩液層交界面出現(xiàn)紫紅色環(huán)，表明可能含有糖、多糖或苷類。 52 ?1．水溶性成分的檢識 取中藥粗粉 5g，加 50ml蒸餾水，浸泡過夜，或于 50～ 60℃ 水浴中溫浸 1小時，濾過，濾液供檢識下列各類成分： 53 （ 1）糖、多糖和苷類 ? 1） Molish反應：取 1ml供試液于試管中，加入 1～ 2滴 10％ α 萘酚乙醇試劑搖勻，傾斜試管 45176。檢識時應盡量采用對尋查成分專屬性強的反應，如蒽醌首選堿液反應；強心苷首選 KellerKiliani反應；皂苷首選泡沫試驗等。每級提取液，可進一步結合化合物的酸堿性不同，采用酸、堿液處理，使其分為酸