【正文】 金霉素分離圖圖 4.. 金。圖 .注意：采用耐酸的色譜柱。采用酸性流動(dòng)相：氯酸 二甲亞砜 水(8:525:467)(pH小于 )取代了 2023年版的流動(dòng)相，分離效果如下。在土霉素、多西環(huán)素中都存在，故在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中應(yīng)規(guī)定與其的分離度。主峰與其有關(guān)物質(zhì)的峰形和分離效果受柱溫影響較大，本品檢測(cè)時(shí)控制柱溫是有必要的。由于流動(dòng)相 pH值在 ，因此需要選擇耐堿性的色譜柱。l (1)圖 .四環(huán)素分離圖出峰順序(RT)峰名稱 4差向四環(huán)素峰（與土霉素色譜峰相對(duì)保留時(shí)間約為 ）10789 土霉素峰 2乙酰 2去酰胺土霉素峰（與土霉素色譜峰相對(duì) 保留時(shí)間約為 ）圖中代號(hào) EP代號(hào) 峰名稱1 E 雜質(zhì) E(土霉素 )2 D 雜質(zhì) D（ 4差向 6差向多西環(huán)素 ,3 C 雜質(zhì) C（ 4差向多西環(huán)素）4 B 雜質(zhì) B（美他環(huán)素）5 A 雜質(zhì) A(β 多西環(huán)素 )多西環(huán)素6 F 雜質(zhì) F(2乙酰 6脫碳酰胺多西環(huán)素 )圖 .L 1醋酸銨 二甲基甲酰胺 四氫呋喃 (600： 398： 2)，內(nèi)含 EDTA鈉（與 2023年版）鹽酸金霉素高氯酸 二甲亞砜 水 (8:525:467)(pH小于 )l L 1醋酸銨 L 1醋酸銨 L 1醋酸銨 L 1醋酸銨 土霉素，四環(huán)素等同系品種經(jīng)系統(tǒng)考察后也采用了上述流動(dòng)相系統(tǒng)，僅在醋酸銨的濃度、比例以及 pH值等條件進(jìn)行了調(diào)整。l 并在流動(dòng)相中添加了少量的 EDTA，用經(jīng)于競(jìng)爭(zhēng)性抑制色譜填料中殘留重金屬離子與四環(huán)素類及雜質(zhì)的絡(luò)合，l 2023年版藥典的起草時(shí)對(duì)流動(dòng)相作了較大修改，對(duì)多西環(huán)素及其制劑色譜分離的影響因素包括水相緩沖鹽的種類和濃度、 pH值、掃尾劑、有機(jī)相、柱溫等進(jìn)行了系統(tǒng)的考察，確定了新的流動(dòng)相 . l 鹽酸四環(huán)素 ,、 、 、 ）分別不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 倍（ % ）、 （ % ）、 （ %）、 （ % ）、 （ % ），其他各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 （ % ）。三批樣品中不存在 2乙酰 2去酰胺四環(huán)素雜質(zhì)，如其他樣品含有 2乙酰 2去酰胺四環(huán)素時(shí)，可將該雜質(zhì)作為其他雜質(zhì)控制，規(guī)定其他雜質(zhì)限度為 % ， 經(jīng)試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)樣品 4差向四環(huán)素的含量均小于 % ，故將《中國(guó)藥典》 2023年版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的 4差向四環(huán)素 ≤% 的限度改為 % ?！? ，差向脫水四環(huán)素 ≤% 。2乙酰 2去酰胺土霉素雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 （ % ），其他各雜質(zhì)峰峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積（% ）。限度為： 國(guó)內(nèi)樣品 4差向土霉素和四環(huán)素的含量很少，故將其作為其他雜質(zhì)控制，不再單獨(dú)規(guī)定限度，其他雜質(zhì)總和 ≤% ；l 2023年版藥典標(biāo)準(zhǔn)中土霉素作為特定雜質(zhì)的單獨(dú)規(guī)定限度，因多批原料及片劑中均未檢出土霉素，故將土霉素作為其他雜質(zhì)控制，另增加對(duì)其他單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的限度控制。l 可能是多西環(huán)素在溶液或放置過(guò)程中生成的差向異構(gòu)體。Hyclate）中有 6個(gè)潛在雜質(zhì)，分別命名為雜質(zhì) A、 B、 C、 D、 E、 F，其中雜質(zhì) Al 如：鹽酸多西環(huán)素《歐洲藥典》 l l 米諾環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素用已知雜質(zhì)對(duì)照品定位，用不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算，l 色譜條件同修改后含量測(cè)定的色譜條件（見(jiàn)表），l 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法仍以 HPLC為主，但測(cè)定條件隨含量測(cè)定方法修改有所改變。l 一般采用 TLC/HPLC、 IR和氯化物反應(yīng)，部分品種增加了紫外鑒別。l 本版四環(huán)類抗生素修訂情況概要l 也可用于四環(huán)類抗生素的分析和鑒定。在無(wú)菌檢查去抑菌作用時(shí)可以利用該性質(zhì)。(3) 四環(huán)類抗生素能與許多金屬離子形成有色絡(luò)合物。在紫外光照射下具有強(qiáng)烈熒光。(2)l 四環(huán)類在較酸溶液中特別在加熱情況下， (1)酸性條件下 :l l 四環(huán)類抗生素的差向異構(gòu)化反應(yīng)，可用下式表示：l l l 四環(huán)類抗生素在酸性（ ～ ）溶液中， A環(huán)上 4位手性碳原子構(gòu)型易發(fā)生差向異構(gòu)化反應(yīng)，形成差向化合物，四環(huán)素、金霉素、去甲環(huán)素等很容易差向化，形成 4差向異構(gòu)體，l l l l 四環(huán)類抗生素的游離堿，在水中的溶解度很小，當(dāng) pH值低于 4或高于 8時(shí)，可以得到高濃度的四環(huán)類化合物的水溶液。四環(huán)類抗生素都是結(jié)晶型物質(zhì)，分子內(nèi)含有蒽酮類發(fā)色團(tuán)，一般為黃色結(jié)晶性粉末，干燥的四環(huán)類游離堿和它們的鹽類都比較穩(wěn)定，但在貯存中遇光促使顏色變深，可能有降解物產(chǎn)生。l 性狀 本品分子結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此有旋光性。l 是兩性化合物。 表 含量測(cè)定HPLC ELSD法柱前衍生化 HPLCUV法微生物 檢 定法 ( 管碟法 )微生物 檢 定法 (濁 度法 ) 微生物 檢 定法 ( 管碟法 或 濁 度法 ) 7 4 5 2 21l 四環(huán)素類抗生素l 四環(huán)類抗生素的基本特點(diǎn)，l l （ 3）硫酸新霉素 有以下五種形式，表 l （ 1）硫酸卡那霉素，硫酸依替米星及其制劑共 7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定為 HPLCELSD方法。l l 例如： 2023年版藥典中 。2023年版中測(cè)定硫酸鹽含量采用的是容量法與傳統(tǒng)的重量法測(cè)定相比，有其先進(jìn)性，但滴定終點(diǎn)突躍不明顯 .l 硫酸鹽 BP2023阿米卡星項(xiàng)下系統(tǒng)適用性色譜l 圖 柱前衍生 HPLC方法首次應(yīng)用在中國(guó)藥典氨基糖苷類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)中，l l l l ELSD屬于通用型檢測(cè)器 ,l 2023年版藥典采用的薄層色譜法 (TLC)測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，屬于半定量方法，只能對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行限度檢查，不能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)量。2023年版藥典除硫酸卡那霉素，硫酸慶大霉素 ,硫酸小諾霉素三個(gè)原料及其制劑共 9個(gè)品種的組分、特定雜質(zhì)檢查方法為 HPLCELSD方法，l HPLCELSD方法擴(kuò)大應(yīng)用，l l l 、組分l 80%120%方法為 檢查羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨，l l 例 2.方法為 HPLC（限度： 硫酸新霉素 本版藥典對(duì)氨基糖苷類抗生素滴眼液中常用防腐劑如羥苯乙酯、丙酯、苯扎氯胺等進(jìn)行檢查。l 妥布霉素滴眼液、慶大霉素滴眼液和硫酸卡那霉素滴眼液（均為滲透壓摩爾濃度為 260320mOsmol/kg）l 本版藥典將其擴(kuò)大為 4個(gè)滴眼液，l l H），應(yīng)符合規(guī)定。每 1g供試品中，含 10μm以上的微粒不得過(guò) 6000粒，含 25μm以上的微粒不得過(guò)600粒。取本品 3g，加微粒檢查用水 100ml，制成每 1ml中含 30mg的溶液，依法檢查（附錄 IXH），應(yīng)符合規(guī)定。硫酸阿米卡星 l 供無(wú)菌分裝的原料標(biāo)準(zhǔn)正文中增加了(1)可見(jiàn)異物、 (2)l 、檢查l l 阿米卡星 l 例 2.（ 3）硫酸鹽鑒別反應(yīng)。（ 2） HPLCl （ 1） TLCl 在鑒別試驗(yàn)中規(guī)定 TLC和 HPLC兩個(gè)色譜鑒別項(xiàng)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件任選其中之一，便于靈活操作。少數(shù)品種有顯色反應(yīng)鑒別。含量測(cè)定或組分采用 HPLCELSD的方法時(shí)，也可用 HPLC作為鑒別，l l 一般采用 TLC法與硫酸鹽反應(yīng)，l 修訂情況概要l l 本類抗生素有效成分為游離鹼，一般均以硫酸鹽形式存在作為藥物，由于都含有易溶于水的氨基糖堿性苷，故均能以分子中的堿性基團(tuán)（ NH2基）與無(wú)機(jī)酸結(jié)合成可溶于水、但幾乎不溶于有機(jī)溶劑的鹽類。l 本類藥物結(jié)構(gòu)中都有以氨基環(huán)己醇與氨基糖縮合而成的苷，結(jié)構(gòu)中沒(méi)有共軛雙鍵所以沒(méi)有可供分析用的特征的紫外吸收僅有末端吸收，結(jié)構(gòu)中具有不對(duì)稱碳原子有旋光性。l 表 含量 測(cè) 定 品種 HPLC 微生物法( 管碟法 或 濁 度法 ) 48 10 38l 氨基糖苷類抗生素 依托紅霉素為紅霉素酯類衍生物，故在微生物法測(cè)定含量時(shí)，必須使藥物完全水解成紅霉素，有抗菌活性后，方能測(cè)定抑菌能力，l 本版藥典進(jìn)行了充分研究后將水解條件由“37℃ 水浴中放置 6小時(shí) ”修訂為 “60℃ 水浴中放置 4小時(shí) ”，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算羅紅 霉素片羅紅 霉素分散片 , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 ,羅紅 霉素干混 懸劑 , , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 ,羅紅 霉素膠囊 , , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 , 酶 的加量以 單 位表示 ,羅紅 霉素 顆 粒（非包衣） , , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 ,克拉霉素片 , , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 ,克拉霉素膠囊 , , 照品外 標(biāo) 法 計(jì) 算 ,表 (2) 溶出度 測(cè) 定 (溶出液 HPLC法 測(cè) 定 )l 含量測(cè)定l 除個(gè)別品種（如克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素）采用 HPLC法外，其他品種均采用微生物檢定法測(cè)定效價(jià)，見(jiàn)表 。,見(jiàn)表。l l 因制劑中某些輔料與硫酸也會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，采用硫酸顯色法時(shí) ,采用自身對(duì)照法，以抵消輔料的干擾；l 同時(shí)多組分品種亦采用自身對(duì)照法，以消除組分比例差異對(duì)結(jié)果的影響。l 共 25個(gè)制劑，其中 2個(gè)紅霉素腸溶制劑檢查釋放度，其他均檢查溶出度；l 顆粒劑中包衣顆粒和非包衣顆粒制訂了相應(yīng)的溶出度檢查法（如羅紅霉素顆粒）；l 混懸顆粒和干混懸劑根據(jù)溶出曲線考察結(jié)果決定是否定入標(biāo)準(zhǔn)。4. 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 210nm 統(tǒng) 適用性增加主峰與 紅 霉素的分離度，并明確前相 鄰雜質(zhì) 峰（相 對(duì) 保留 時(shí)間為 ）和后相 鄰雜質(zhì) 峰（相 對(duì) 保留 時(shí)間為 ）位置琥乙 紅 霉素 方法（ TLC法）l 溶出度l 除乳糖酸紅霉素是供注射用外，其他均為口服制劑（片、膠囊、干混懸劑、顆粒）。表 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 (1) 品種 方法（ HPLC）丙酸交沙霉素 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 231nm交沙霉素 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 231nm克拉霉素 克拉霉素片克拉霉素膠囊克拉霉素 顆 粒 對(duì) 照2． 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 210nm阿奇霉素阿奇霉素干混 懸劑阿奇霉素片阿奇霉素分散片阿奇霉素膠囊阿奇霉素 顆 粒 TLC法修 訂為 HPLC法，無(wú) 該項(xiàng)檢查 的已增 訂（阿奇霉素 Gx為 紅 霉素 A偕 亞 胺 醚為 ）與不加校正因子（阿奇霉素 B和其他 單 個(gè) 雜質(zhì) ）的自身 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 210nm 劑 用，不同限度 劑 扣除相 對(duì) 保留 時(shí)間 輔 料峰紅 霉素 （ 紅 霉素 烯 醇 醚為 雜質(zhì) 1為 ）與不加校正因子的自身 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 215nm乳糖酸 紅 霉素注射用乳糖酸 紅 霉素（ 紅 霉素 烯 醇 醚為 雜質(zhì) 1為 ）與不加校正因子的自身 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 215nm表 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 (2) 品種 方法（ HPLC）硬脂酸 紅 霉素硬脂酸 紅 霉素片硬脂酸 紅 霉素膠囊（ 紅 霉素 烯 醇 醚為 雜質(zhì) 1為 ）與不加校正因子的自身 對(duì) 照 波 長(zhǎng) 215nm依托 紅 霉素 紅 霉素 標(biāo) 法 計(jì) 算 檢測(cè) 波 長(zhǎng) 190nm麥白霉素 A1為 基準(zhǔn) ,外 標(biāo) 法 計(jì) 算各有關(guān)物 質(zhì)總 量（不得 過(guò) 25%）檢測(cè) 波 長(zhǎng) 232nm麥白霉素片 A1為 基準(zhǔn) ,外 標(biāo) 法 計(jì) 算各有關(guān)物 質(zhì)總 量（不得 過(guò) 30%） 波 長(zhǎng) 232nm麥白霉素膠囊 A1為 基準(zhǔn) ,外 標(biāo) 法 計(jì) 算各有關(guān)物 質(zhì)總 量（不得 過(guò) 30%） 波 長(zhǎng) 232nm羅紅 霉素羅紅 霉素片羅紅 霉素分散片羅紅 霉素膠囊 對(duì) 照 酰 胺峰外，并 對(duì)該 峰定位。l 有關(guān)物質(zhì)l 除琥乙紅霉素仍采用 TLC法外， 2023年版采用 TLC法的品種均修訂為 HPLC法，共 26個(gè)品種采用 HPLC法；l 完善了 HPLC系統(tǒng)適用性要求，明確主峰與指定雜質(zhì)的分離度，確保方法的有效性和準(zhǔn)確性；l l 增加特定雜質(zhì)的控制（如阿奇霉素）和總雜的控制（如羅紅霉素）；l 首次對(duì)紅霉素及其衍生物有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行了統(tǒng)一。l 測(cè)定方法 :HPLC，色譜柱 C1檢測(cè)波長(zhǎng) 232nml 紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素l 紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素主要組分均為紅霉素 A、 B、 C .l 測(cè)定方法： HPLC法，色譜柱 C18 , l 檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm；l l 3個(gè)品種規(guī)定限度相同：l 紅霉素 A: 以無(wú)水物計(jì)不得少于 %，用對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算 .l 紅霉素 B: 不得大于 5%,用加校正因子（ ）的自身對(duì)照法計(jì)算。 紅 霉素Ａ峰與 紅 霉素 烯 醇 醚 峰的分離度 應(yīng) 大于 ， 紅